Реакция вирусной нейтрализации, её механизм.

Занятие 12. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Реакция вирусной нейтрализации (РН).

Реакция вирусной гемагглютинации. Механизм, постановка, регистрация.

В основе реакции гемагглютинации лежит феномен склеивания эритроцитов, происходящий под влиянием различных факторов. Различают прямую и непрямую гемагглютинацию.
При реакции прямой гемагглютинации происходит склеивание эритроцитов при адсорбции на них определенных антигенов, например вирусов.

Реакция непрямой гемагглютинации (пассивная гемагглютинация) наблюдается в тех случаях, когда к эритроцитам, заранее обработанным (сенсибилизированным) различными антигенами, прибавляют иммунную сыворотку или сыворотку больного, имеющую соответствующие антитела. Происходит специфическое склеивание эритроцитов, их пассивная гемагглютинация.

Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации по чувствительности и специфичности превосходит другие серологические методы, и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими.

Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации состоит из нескольких этапов. Вначале эритроциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия, затем при необходимости (при использовании антигенов белковой природы) их обрабатывают раствором танина 1:20000 и сенсибилизируют растворимыми антигенами. После отмывания буферным изотоническим раствором хлорида натрия эритроцитарный антиген готов к употреблению. Исследуемые сыворотки разводят изотоническим раствором хлорида натрия в пробирках или специальных пластмассовых пластинках с луночками, затем к каждому разведению сыворотки добавляют эритроцитарный диагностикум. Результаты реакции непрямой гемагглютинации учитывают по характеру осадка эритроцитов, образовавшегося на дне пробирки. Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки. При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска или «пуговки» располагаются в центре дна пробирки.

РТГА, её механизм, способы постановки: при определении вируса, при серодиагностике вирусных инфекций.

Широко используется при исследовании гемагглютинирующих вирусов.

Основана на том, что антитела при встрече с гомологичным вирусом (антигеном) нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемагглютинирующую активность, так как блокируют рецепторы вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними комплекс антиген + антитело.

Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке (лунке) смешивают равные объемы сыворотки крови и вируса и после экспозиции (30—40 мин) добавляют эритроциты соответствующего вида животного.

Выбор эритроцитов зависит от вируса, используемого в РТГА. Так, для вирусов гриппа используют эритроциты кур, для ПГ-3 КРС — эритроциты морской свинки. Обычно используют 0,5—1%-ную взвесь эритроцитов.

Эритроциты являются индикатором наличия вируса в смеси. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие вируса в смеси, а отсутствие гемагглютинации — на его отсутствие, так как антитела полностью нейтрализовали гемагглютинирующую активность вируса.

РТГА можно ставить в двух вариантах:

1) к разным разведениям сыворотки (обычно 2-кратным) добавляют одинаковые дозы вируса (4—8 ГАЕ);

2) к разным разведениям вируса (обычно 2-кратным) добавляют одинаковые дозы сыворотки.

Сыворотки, используемые в РТГА, должны быть предварительно освобождены от термолабильных и термостабильных ингибиторов.

Постановку РТГА по первому варианту проводят по следующим этапам:

• титруют вирус в РГА и определяют его гемагглютинирующий титр;
• приготовляют и контролируют рабочую дозу вируса (4 или 8 ГАЕ);
• ставят главный опыт РТГА;
• учитывают результаты.

Позитивной реакцией считают образование красного зернистого с неравными краями осадка, который диффузно располагается на дне пробирки. О негативном результате свидетельствует наличие компактного осадка в виде "пуговицы" на дне пробирки или лунки, который может стекать при ее наклонении. При частичной агглютинации образуется осадок в виде кольца.

Оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах и определяют титр антител. За титр антител в сыворотке принимается наивысшее разведение сыворотки, которое еще полностью тормозит гемагглютинацию.

РТГА ставят в пробирках, специальных полистироловых планшетах макро- или микрометодом.

РГТА позволяет решить следующие диагностические задачи:

• обнаружить и определить титр антител в сыворотке крови с помощью известного вируса;
• идентифицировать неизвестный вирус путем исследования его с различными заведомо известными сыворотками (антителами).

Достоинства РТГА — простота техники постановки и быстрый результат. Однако эту реакцию можно использовать только для гемагглютинирующих вирусов.

Реакция вирусной нейтрализации, её механизм.

Принцип реакции основывается на взаимодействии специфических антител иммунной сыворотки с вирусом, которое приводит к нейтрализации последнего. Реакцию можно ставить в культурах клеток с учетом результатов по цитопатическому действии, в цветной пробе, с помощью рН-метрии и феноменом бляшкообразования. Кроме того можно использовать для постановки реакции другие живые системы - куриные эмбрионы и лабораторные животные.

При изучении нейтрализации цитопатического действия вирусов в культуре клеток компонентами реакции является вируссодержащий материал (культуральная жидкость, инфицированные или дезинтегрованные культуры клеток), иммунная противовирусная сыворотка, специальные питательные среды (солевой раствор Хенкса, среды Игла, 199 и тому подобное) и культура клеток в пробирках или флаконах. Ее подбирают в зависимости от биологических свойств вирусов. Чаще всего используют культуры клеток HeLa, СМЦ, почек обезьян, первичные культуры клеток куриных или человеческих эмбрионов.

Из материала, который содержит вирусы, предварительно готовят последовательные десятикратные разведения от 10-1 до 10-8. По 0,1 мл каждого разведения вносят в пробирки, в которых находится культура клеток. Перед проведением опыта в пробирках заменяют питательную среду. Как правило, заражают по три пробирки с культурой клеток для каждого разведения вируссодержащего материала. Контролем являются культуры клеток, которые не инфицируют вирусом. Клеточные культуры инкубируют при 37°С в течение 5-7 дней. Результаты оценивают за наличием или отсутствием цитопатического действия. Определяют 50 % тканевое цитопатическое действие вирусов (ТЦД50), то есть наибольшее разведение вирусов, которое вызывает цитопатический эффект в 50 % зараженных клеток.

В основном опыте используют пробирки с разведениями иммунной сыворотки, куда вносят стандартную дозу вируса (чаще всего 100 ТЦД50), а после инкубации при комнатной температуре в течение 30-60 мин. добавляют однослойные культуры клеток. Систему инкубируют при 37°С в течение одной недели и учитывают наличие цитопатического эффекта. Отсутствие его свидетельствует о нейтрализации вируса, который изучается, специфической иммунной сывороткой. По идентичной схеме реакцию можно ставить в специальных полистироловых планшетах.

Цветная проба предусматривает, что при взаимодействии вирусов с культурой клеток последние погибают, рН среды остается щелочным, и цвет индикатора не изменяется. При нейтрализации вирусов антителами специфической сыворотки или при отсутствии соответствующих вирусов создаются условия для развития культур клеток. Они остаются живыми, активно осуществляют обмен веществ, в результате чего образуются продукты клеточного метаболизма, которые сдвигают рН среды в кислую сторону. Это приводит к изменению цвета индикатора фенолрота из красного (щелочное рН) на соломенно-желтый или оранжевый (кислое значение рН).

При постановке реакции сначала смешивают 0,25 мл исследуемого вируссодержащего материала, который содержит 100 ТЦД50, с разными разведениями специфической противовирусной иммунной сыворотки. После 30-60-минутной инкубации при температуре 37°С в пробирки добавляют по 0,25 мл клеточной суспензии с индикатором фенолротом и заливают их слоем вазелинового масла или закрывают резиновыми пробками. Пробирки выдерживают в термостате при 37°С в течение одной недели, а потом читают результаты. При позитивном тесте в опытных пробирках наблюдают изменение цвета индикатора из красного на оранжевый.

Оценить результаты реакции можно также непосредственно измеряя значение рН среды с помощью иономера. Цветную пробу особенно часто используют для лабораторной диагностики полиомиелита.

Надежным методом идентификации вирусов является реакция нейтрализации бляшкообразования вирусов в культурах клеток. Принцип реакции заключается в том, что антитела специфической иммунной сыворотки, которые нейтрализуют вирусы, способствуют уменьшению числа бляшек - зон некрозов - в однослойной культуре клеток.

Для постановки реакции на однослойную культу клеток в чашках или матрасах наносят смесь вирусов и специфической иммунной сыворотки, которые предварительно инкубируемые при 37°С в течение 1 часа для нейтрализации. После этого поверхность монослоя клеток заливают освещенным индифферентным агаром в смеси со всеми необходимыми компонентами и суправитальным красителем нейтральным красным. Зараженные клетки инкубируют во влажной камере в атмосфере из 5 % углекислого газа в течение 5 суток при температуре 37 °С.

Более чувствительным методом изучения образования бляшек является использование бентонитового покрытия. Этот метод приобрел широкое приложение при изучении энтеровирусов. Особенность его заключается в том, что заражены смесью вирусов и иммунные сыворотки, монослои культуры клеток заливают жидкой питательной средой, которая содержит гель бентонита. Частицы бентонита адсорбируются на поверхности культур клеток и тормозят свободное распространение вирусов среди клеток. Уже через 2 дня после заражения появляются вирусные бляшки в виде прозрачных пятен на молочно-матовом фоне монослоя клеток.

О нейтрализующей активности сыворотки свидетельствует уменьшение числа и величины бляшек, которые образуются под агаровым покрытием в сравнении с контролем без специфической сыворотки. Реакцию считают позитивной, если число бляшек или их величина уменьшились на 80 % в сравнении с контролем. Нейтрализующим титром сыворотки является то ее наибольшее разведение, при котором еще наблюдают нейтрализацию вирусов, которая предупреждает образование бляшек в культуре клеток.

При постановке реакции нейтрализации в куриных эмбрионах или лабораторных животных их заражают смесью вируссодержащего материала и специфической иммунной сыворотки. При учете результатов учитывают количество погибших эмбрионов или животных, образования зон некрозов на хорион-аллантоисной оболочке куриных эмбрионов или оценивают степень нейтрализации вирусов по их, например, гемагглютинирующей активности. РН часто применяют для лабораторной диагностики герпеса, гриппа, парагриппа, паротита, полиомиелита и тому подобное.

 

 

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: