 |
Определение концентрации глюкозы (оптически активных веществ) в растворе поляриметром.
|
|
|
|
Лабораторный практикум
Лабораторная работа №1
Определение концентрации растворов при помощи рефрактометра
Приборыиоборудование: рефрактометр, пипетка, набор растворов различной концентрации.
Цельработы: изучение принципа работы рефрактометра и исследование зависимости между показателем преломления раствора и концентрацией.
Краткая теория
Значение темы в системе знаний биолога (биоэколога) (самостоятельно)
Метод основан на сложной зависимости между показателем преломления раствора и концентрацией растворённых веществ. Значение показателя преломления раствора, определяемого при помощи рефрактометра, зависит от концентрации растворенного вещества и температуры. При неизменной температуре, показатель преломления линейно связан с концентрацией. Для сахарных растворов эта зависимость хорошо изучена и, как правило, отображается на шкале прибора, по которой непосредственно определяется концентрация сахара в растворе. Для определения концентрации какого-либо другого вещества (не сахара) пользуются эмпирической зависимостью между концентрацией этого вещества в растворе и его показателем преломления при фиксированном значении температуры.
Вследствие взаимодействия электромагнитной волны со средой, изменяется скорость её распространения. Эта зависимость имеет вид: v=c/n, где n= 
-абсолютный показатель преломления вещества, v – скорость света в среде, а с – скорость света в вакууме. При переходе света через границу раздела двух сред, скорость распространения света в которых различна, происходит изменение его направления. Это явление называется преломлением или рефракцией света. Явление рефракции света легло в основу метода определения концентрации разбавленных растворов по эмпирической зависимости между показателем преломления и концентрацией раствора.
|
|
|
Относительный показатель преломления сред
n21=n2/n1
где n2 и n1 - абсолютные показатели преломления сред.
При переходе света из среды с меньшим показателем преломления (оптически менее плотная среда) в среду с большим показателем преломления (оптически более плотная среда) угол падения луча больше угла преломления. Если луч падает на границу раздела сред под наибольшим возможным углом i=p/2 (луч скользит вдоль границы раздела сред), то он будет преломляться под углом r<p/2. Этот угол является наибольшим углом преломления для данных сред и называется предельным углом преломления. Из закона преломления света следует
, откуда
sin rпр=n1/n2
Если свет переходит из оптически более плотной среды в оптически менее плотную, то угол преломления больше угла падения. При некотором угле падения i луча угол преломления равен p/2, т.е. преломлённый луч скользит вдоль границы раздела сред. При дальнейшем увеличении угла падения преломление не происходит, весь падающий свет отражается от границы раздела сред (полное отражение). Угол i называется предельным углом полного отражения и обозначается iпр. Так как
,
то
sin i пр= n2 / n1
Таким образом, предельный угол преломления и предельный угол полного отражения для данных сред зависят от их показателей преломления. Это нашло применение в приборах для измерения показателя преломления веществ - рефрактометрах, используемых при определении чистоты воды, концентрации общего белка сыворотки крови, для идентификации различных веществ и так далее.
Описание установки
Основной частью рефрактометра являются две прямоугольные призмы 1 и 2, сделанные из одного и того же сорта стекла (рис.1,а). Призмы соприкасаются гипотенузными гранями, между которыми имеется зазор около 0,1 мм. Между призмами помещают каплю жидкости, показатель преломления которой требуется определить. Луч света от источника 3 направляется на боковую грань верхней призмы и, преломившись, попадает на гипотенузную грань АВ. Поверхность АВ матовая, поэтому свет рассеивается и, пройдя через исследуемую жидкость, падает на грань CD нижней призмы под различными углами от 0 до 90°. Если показатель преломления жидкости меньше показателя преломления стекла, то лучи света входят в призму 2 в пределах от 0 до rпр. Пространство внутри этого угла будет освещенным, а вне его – тёмным. Таким образом, поле зрения, видимое в зрительную трубу, разделено на две части: тёмную и светлую. Положение границы раздела света и тени определяется предельным углом преломления, зависящим от показателя преломления исследуемой жидкости.
|
|
|
Если исследуемая жидкость имеет большой показатель поглощения (мутная, окрашенная жидкость), то во избежание потерь энергии при прохождении света через жидкость измерения проводят в отраженном свете. Ход лучей в рефрактометре в этом случае показан на рис.1,б. Луч света от источника проходит через матовую боковую грань СМ нижней призмы 2. При этом свет рассеивается и падает на гипотенузную грань CD, соприкасающуюся с исследуемой жидкостью, под всевозможными углами от 0 до 90°. Если жидкость оптически менее плотная, чем стекло, из которого изготовлена призма, то лучи, падающие под углами, большими iпр, будут испытывать полное отражение и выходить через вторую боковую грань нижней призмы в зрительную трубу. Поле зрения, видимое в зрительную трубу, так же как и в первом случае, окажется разделенным на светлую и тёмную части. Положение границы раздела в данном случае определяется предельным углом полного отражения, также зависящем от показателя преломления исследуемой жидкости.
С помощью этого прибора можно исследовать вещества, показатель преломления которых меньше показателя преломления стекла измерительных призм. Оптическая система рефрактометра изображена на рис. 2.
В рефрактометре используется источник 3 белого света. Вследствие дисперсии при прохождении светом призм 1 и 2 граница света и тени оказывается окрашенной. Во избежание этого перед объективом зрительной трубы помещают компенсатор 4. Он состоит из двух одинаковых призм, каждая из которых склеена из трех призм, обладающих различным показателем преломления. Призмы подбирают так, чтобы монохроматический луч с длиной волны l = 589,3 мкм. (длина волны желтой линии натрия) не испытывал после прохождения компенсатора отклонения. Лучи с другими длинами волн отклоняются призмами в различных направлениях. Перемещая призмы компенсатора с помощью специальной рукоятки, добиваются того, чтобы граница света и темноты стала возможно более чёткой.
|
|
|
Лучи света, пройдя компенсатор, попадают в объектив 6 зрительной трубы. Изображение границы раздела свет – тень рассматривается в окуляр 7 зрительной трубы. Одновременно в окуляр рассматривается шкала 8. Так как предельный угол преломления и предельный угол полного отражения зависят от показателя преломления жидкости, то на шкале рефрактометра сразу нанесены значения этого показателя преломления.
Оптическая система рефрактометра содержит также поворотную призму 5. Она позволяет расположить ось зрительной трубы перпендикулярно призмам 1 и 2, что делает наблюдение более удобным.
В общей фокальной плоскости объектива и окуляра зрительной трубы помещают стеклянную пластинку, на которую нанесена визирная линия (или крест, образованный тонкими нитями). Перемещением зрительной трубы добиваются совпадения визирной линии с границей свет – тень и по шкале определяют показатель преломления исследуемой жидкости. В некоторых современных рефрактометрах зрительная труба укрепляется неподвижно, а система измерительных призм может поворачиваться.
Порядок выполнения работы
1. Подготовка прибора к работе:
а) расположите источник света так, чтобы наблюдения проводились в проходящем свете;
б) откиньте верхнюю призму рефрактометра и пипеткой нанесите на нижнюю призму 2-3 капли дистиллированной воды. Опустите верхнюю призму;
в) фокусируя окуляр, получите резкие изображения поля зрения, визира и шкалы;
|
|
|
г) перемещая зрительную трубу, получите в поле зрения границу свет – тень. Линия раздела должна быть резкой и без цветной окраски. Последнее достигается поворотом рукоятки компенсатора;
д) совместите визир с границей раздела свет – тень. При правильной настройке рефрактометра показание шкалы при этом должно соответствовать показателю преломления воды n = 1,333 (при 20° С).
2. Исследование зависимости показателя преломления раствора NaCl от концентрации:
а) измерьте показатели преломления n раствора NаCl различной концентрации С. Для этого на нижнюю призму нанесите поочередно растворы различной концентрации и, совмещая визир с границей раздела свет – тень, определите по шкале показатели преломления растворов. Для каждого раствора измерение показателя преломления производите 3 раза и найдите <n>;
Таблица 1
| С, % | n1 | n2 | n3 | <n> |
б) результаты измерений занесите в таблицу 1;
в) постройте график зависимости показателя преломления от концентрации
n = f(C);
г) измерьте показатель преломления nx раствора неизвестной концентрации. Определите по графику концентрацию Сx этого раствора;
д) найдите по графику погрешность DСx измерения концентрации раствора.
3. Задание на усмотрение преподавателя.
Вопросы и упражнения для самоподготовки:
1. Сформулируйте законы отражения и преломления света.
2. Что называется предельным углом преломления?
3. В чем заключается явление полного отражения?
4. Что называется предельным углом полного отражения?
5. Опишите устройство рефрактометра.
6. Начертите ход лучей в рефрактометре в проходящем и отраженном свете.
7. С какой целью применяется рефрактометр в медико – биологических исследованиях?
8. Для чего гипотенузная грань верхней призмы делается матовой?
9. Чем определяется положение границы свет – тень в рефрактометре?
10. Определите, при каком угле падения луч, отраженный от границы раздела двух сред перпендикулярен преломленному лучу.
11. Найдите показатель преломления среды, если луч, преломленный на границе этой среды с воздухом перпендикулярен отраженному, а синус угла падения равен 0,8.
Лабораторная работа №2
Определение концентрации глюкозы (оптически активных веществ) в растворе поляриметром.
Приборыипринадлежности: поляриметр П-161М, кюветы с растворами сахара и глюкозы.
Цельработы: изучение принципа работы поляриметров, определение удельного вращения растворов сахара и глюкозы, определение концентрации сахара (или глюкозы) в растворе.
Краткая теория
Значение темы в системе знаний биолога (биоэколога) (самостоятельно)
|
|
|
Свет – это электромагнитные волны. Химическое и биологическое действие света в основном связано с электрической составляющей поля электромагнитной волны. Поэтому вектор напряженности Е электрического поля называется световым.
Естественный свет представляет собой совокупность волн, излучаемых множеством атомов и молекул источника света. Колебания световых векторов происходят во всевозможных направлениях, и поэтому плоскости их колебаний постоянно меняют свое положение в пространстве.
Если же направления колебаний светового вектора упорядочены каким–либо образом, то свет называется поляризованным. При некоторых условиях можно получить свет, в котором плоскость колебаний вектора Е занимает постоянное положение в пространстве. Такой свет называется плоскополяризованным. Плоскость в которой происходят колебания вектора Е, называется плоскостью поляризации.
Глаз не отличает естественный свет от поляризованного, но имеется целый ряд явлений, свойственных только поляризованному свету, благодаря которому он и обнаруживается. Поляризованный свет можно получить из естественного с помощью поляризатора (призма Николя, поляроид и др.). Он пропускает колебания, параллельные только одной (главной) плоскости, и полностью задерживает колебания, перпендикулярные этой плоскости.
Чтобы исследовать, является ли свет после прохождения поляризатора действительно плоскополяризованным, на пути лучей ставят второй поляризатор, который называют анализатором, указывая этим, что он используется не для получения, а для анализа поляризованного света.
Пусть колебания вектора Е поляризованной световой волны совершаются в плоскости, составляющей угол j с главной плоскостью анализатора. Амплитуду Е этих колебаний можно разложить на две взаимно перпендикулярные составляющие: Е1 – совпадающую с главной плоскостью анализатора и Е2 – перпендикулярную ей (рис.3).
Е1=E cosj, Е2=Е sinj.
Первая составляющая колебаний пройдет через анализатор, вторая будет задержана им. Интенсивность света пропорциональна квадрату амплитуды; следовательно, интенсивность света, прошедшего через анализатор, пропорциональна Е2cos2j (закон Малюса):
I = I0 cos2j,
где I0 - интенсивность поляризованного света, падающего на анализатор; j - угол между плоскостью поляризации падающего света и плоскостью анализатора.
Если плоскости поляризатора и анализатора 
параллельны, j = 0, p, т.е. cosj=±1, то экран, помещенный за анализатором, будет максимально освещённым.
Если j = p/2, 3p/2, т.е. cosj = 0 (поляризатор и анализатор скрещены), то экран будет тёмным. При прохождении поляризованного света через некоторые вещества наблюдается вращение плоскости поляризации. Такие вещества называются оптически активными. К их числу относят кристаллические тела (кварц, киноварь и др.), чистые жидкости (скипидар, никотин и др.) и растворы некоторых веществ (водные растворы сахара, винной кислоты и др.).
Вращение плоскости поляризации растворами обусловлено взаимодействием электромагнитной волны с асимметричными (хиральными) молекулами растворённого оптически активного вещества. Особенностью таких молекул является наличие в их составе неспаренного электрона. Такие молекулы не обладают зеркальной симметрией, т.е. при их «отражении» в зеркале возникает противоположная форма. Молекулы с одинаковой химической формулой, но разной структурой поворачивают плоскость поляризации в разных направлениях. Различают правовращающие и левовращающие вещества. «Левая» молекула является зеркальным отображением «правой». Механизм поворота плоскости колебания электрического вектора основан на сильном влиянии на неспаренный электрон со стороны таких же электронов в составе соседних хиральных молекул. Величина угла поворота плоскости поляризации пропорциональна концентрации оптически активного вещества и длине пробега луча в этом веществе.
В растворах угол a поворота плоскости поляризации пропорционален пути l луча в растворе и концентрации с раствора:
a = [a0]cl,
где [a0] – удельное вращение. Оно обратно пропорционально квадрату длины волны, зависит от природы вещества и температуры и численно равно увеличенному в 100 раз углу поворота плоскости поляризации слоем раствора толщиной 10 см при концентрации вещества 1 гр на 100 см3 раствора, температуре 20°С и длине волны света l = 589 нм.
Удельное вращение сахара равно 66,5 град´см3/(г´дм)=0,665 град´м2/кг, глюкозы – 0,528 град´м2/кг.
При пропускании поляризованного света через раствор оптически активного вещества плоскости поляризации волн различной длины будут поворачиваться на различные углы. В зависимости от положения анализатора через него проходят лучи различной окраски. Это явление называется вращательной дисперсией.
Если между поляризатором и анализатором, плоскости поляризации которых взаимно перпендикулярны, поместить кювету с раствором оптически активного вещества, то поле зрения просветляется. Чтобы снова получить полностью затемненное поле зрения, необходимо анализатор повернуть на угол a поворота плоскости поляризации света при прохождении через кювету с раствором. Зная удельное вращение данного вещества и длину кюветы, можно определить концентрацию раствора:
Метод, применяемый при качественном и количественном анализе различных веществ с помощью поляриметра, называется поляриметрией. Он широко используется в медицине и биологии (например, для определения оптической активности сывороточных белков с целью диагностики рака), в клинической практике (например, для количественного определения содержания сахара в моче). Поляриметр, применяемый для этой цели, называется сахариметром.
Описание установки.
В работе используется поляриметр портативный П-161, внешний вид которого изображен на рисунке 4. Оптическая схема прибора изображена на рисунке 5.
Источником света в поляриметре может являться лампа накаливания или солнечный свет, направляемый при помощи зеркальца. Свет от источника падает на светофильтр Ф и объектив О. Полученный монохроматический свет проходит через поляризатор П, кювету Т с раствором и анализатор А. В качестве анализатора и поляризатора в приборе используются поляроиды. После анализатора свет проходит через объектив Об и окуляр Ок зрительной трубы сахариметра, которая служит для визуального наблюдения поля зрения.
Вследствие адаптации глаза визуально трудно оценивать абсолютную освещенность. В то же время легко сравнивать освещенность различных частей поля зрения. Для разделения поля зрения на части в сахариметре непосредственно за поляризатором расположена тонкая кварцевая пластинка К, через которую проходит средняя часть пучка поляризованного света, вышедшего из поляризатора.
В результате введения кварцевой пластинки поле зрения поляриметра оказывается разделенным на три части. Средняя часть освещается светом, прошедшим через поляризатор, кварцевую пластинку и анализатор, а две крайние части поля зрения - светом, прошедшим через поляризатор и анализатор. Так как кварц является оптически активным веществом, то после прохождения поляризованного света через пластинку его плоскость поляризации поворачивается на некоторый угол (рис.6).
Поворачивая анализатор, можно получить равномерно освещенное поле зрения. Это будет происходить при двух положениях анализатора: 1) плоскость АА анализатора совпадает с биссектрисой угла между направлениями колебаний в средней и крайней частях поля зрения (рис.7,а); 2) плоскость анализатора перпендикулярна биссектрисе угла между направлениями колебаний (рис.7,б). В одном случае яркость поля зрения будет больше, в другой - меньше. При работе с сахариметром следует уравнивать части поля зрения при меньшей яркости.
Если установить анализатор на равную освещенность всех частей поля зрения, а затем поместить между поляризатором и анализатором трубку с раствором сахара, то равенство яркостей средней и крайней частей поля зрения нарушиться. Это происходит вследствие того, что во всех частях поля зрения плоскость колебаний светового вектора повернется на один и тот же угол a (рис.8). Для восстановления равенства освещенностей необходимо повернуть анализатор на этот же угол a, равный углу поворота плоскости поляризации света при прохождении им раствора сахара.
|
|
|
