По закону действующих масс: Из этого закона следует, что при повышении концентрации субстрата автоматически повышается скорость ферментативной реакции.

Вопрос 5.

Вопрос 6. 1. Гомогенизация – это тщательное измельчение объектов биохимического исследования до однородного, то есть гомогенного состояния, то есть белки подвергаются тщательной дезинтеграции вплоть до разрушения клеточной стенки. При этом используют:

а) ножевые гомогенизаторы типа Уорринга;

б) пестиковые гомогенизаторы Поттера - Эльвегейма;

в) шаровые и валковые мельницы – для более плотных объектов;

2. Экстракция белков, то есть их перевод в растворенное состояние; чаще всего экстракцию проводят вместе с измельчением одновременно.

Экстракцию проводят:

а) растворением в 8-10% растворах солей;

б) с использованием буферных растворов с рН от кислых до слабощелочных (боратных, фосфатных, цитратных, трис - буферных: смесь трисаминометана с NH2 – CH3 + HCl;

в) осаждение белков органическими растворителями (этанол, метанол, бутанол, ацетон и их комбинациями), при этом происходит расщепление белково-липидных и белково-белковых компонентов, то есть разрушение ЧСБ.

3. Очистка и фракционирование белков. После экстрагирования производят разделение или фракционирование смеси на индивидуальные белки и их дальнейшую очистку:

а) высаливание – это процесс осаждения белков нейтральными солевыми растворами щелочных и щелочноземельных металлов.

Метод Кона применяют в фармацевтическом производстве при получении кровезаменителей;

б) методы хроматографии. Основоположником разработки хроматографических методов анализа считается русский ученый Михаил Цвет (1903). В настоящее время существует много ее разновидностей. В основе метода лежит способность веществ специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонку или помещенном на каком-либо носителе. При этом происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают соответствующие элюенты (растворители), которые ослабляют силы адсорбции и вымывают адсорбированные вещества из колонки. Вещества собираются в коллекторе фракций.

Вопрос 7,8,9. Структура ферментов. Ферменты делятся на простые и сложные. Простые ферменты являются белками и состоят только из аминокислот (например, ферменты 3 класса - гидролазы ). Сложные ферменты состоят из белкового компонента (апофермента) и небелкового (кофактора). Кофактор может быть неорганической (металлы) и органической природы и в зависимости от прочности связи с апоферментом делятся на простетические группы (прочно, ковалентно связаны с апоферментом) и коферменты (слабо, нековалентно связаны с апоферментом). В целом сложный фермент (апофермент + кофактор) называется холоферментом.

Вопрос 11,12. Если кофактор прочно связан с ферментом и остается в этом связанном состоянии постоянно, то его называют простетической группой (от греч. prosthekf — добавление). Роль простетических групп играют органические молекулы. Они помогают ферменту осуществлять его каталитическую функцию, как это видно на примере флавинадениндинуклеотида (ФАД).

Гем — это железосодержащая простетическая группа. Его молекула имеет форму плоского кольца, в центре которого находится атом железа. Гем выполняет в организме ряд биологически важных функций. Перенос электронов. В качестве простетической гем выступает как переносчик электронов. Присоединяя электроны, железо восстанавливается до Fe(II), а отдавая их, окисляется до Fe(III). Гем, следовательно, принимает участие в окислительно-восстановительных реакциях за счет обратимых изменений валентности железа. Перенос кислорода. Гемоглобин и миоглобин — два гемсодержащих белка, осуществляющих перенос кислорода. Железо находится в них в восстановленной, Fe(II), форме. Каталитическая функция. Гем входит в состав каталаз и пероксидаз, катализирующих расщепление пероксида водорода до кислорода и воды. Содержится он также и в некоторых других ферментах.

Коферменты, как и простетические группы, — это органические молекулы, выполняющие функцию кофакторов, но в отличие от простетических групп они сохраняют связь с ферментом только в ходе реакции. Все коферменты представляют собой производные витаминов.

Классификация коферментов.

1. По химической природе: 1) витаминные; 2) витаминоподобные; 3) невитаминные.

2. По механизму действия: 1) переносчики атомов водорода, электронов и протонов.

2) переносчики отдельных химических групп.

Коферменты І группы переносчики атомов водорода, электронов и протонов:

А. Невитаминные: гем, глутатион,

Б. Витаминные: аскорбиновая кислота (АК), НАД и НАДФ, ФАД и ФМН,

5-дезоксиаденозилкобаламин.

В. Витаминоподобные: убихинон (коэнзим Q), липоєвая кислота (ЛК), тетрагидробиоптерин

(ТГБП), хиноновые коферменты.

Коферменты ІІ группы (переносчики различных химических групп):

А. Невитаминные: фосфаты нуклеозидов, фосфаты углеводов.

Б. Витаминные: ТДФ, КоА, ПАЛФ, биоцитин, ТГФК, метилкобаламин, витамины К и А

Вопрос 13. Активный центр – это участок фермента, который взаимодействует с субстратом. Ак- тивных центров может быть 2, 4, 6, 8, в каждый входят 7-15 аминокислот. Наиболее часто в состав активных центров ферментов входят функциональные группы таких аминокислот: - ОН – группы серина, треонина, тирозина; - SН – группы цистеина; - NН – группа гистидина; -СООН – группы глутамата и аспартата; -NН2 – группы аргинина и лизина. В сложных ферментах в активный центр входят кофакторы (небелковые компоненты): простетические группы, коферменты, ионы металлов. Активный центр является комплемен-тарным к строению S, имеется соответствие (комплементарность) Е и S как “ключа и замка”. В структуре активного центра выделяют: • участок, который связывается с субстратом: контактный (“якорный”) участок; • каталитический участок, в состав которого входят химические группы, принимающие непосредственное участие в преобразовании субстрата (-ОН, -SH, =N, -NH3 +, СООН ). Возникает на уровне третичной структуры белка-фермента.

Каталитический центр простого фермента представляет собой уникальное сочетание нескольких аминокислотных остатков, расположенных на разных участках полипептидной цепи. Образование каталитического центра происходит одновременно с формированием третичной структуры белковой молекулы фермента. Чаще всего в состав каталитического центра простого фермента входят остатки серина, цистеина, тирозина, гистидина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот.

Субстратный центр простого фермента - это участок белковой молекулы фермента, который отвечает за связывание субстрата. Субстратный центр образно называют "якорной площадкой", где субстрат прикрепляется к ферменту за счет различных взаимодействий между определенными боковыми радикалами аминокислотных остатков и соответствующими группами молекулы субстрата. Субстрат с ферментом связывается посредством ионных взаимодействий, водородных связей; иногда субстрат и фермент связываются ковалентно. Гидрофобные взаимодействия также играют определенную роль при связывании субстрата с ферментом.

У сложных ферментов в активном центре обязательно расположены функциональные группы кофактора.

Вопрос 16,17. Аллостерический центр (allos – чужой) – центр регуляции активности фермента, который пространственно отделен от активного центра и имеется не у всех ферментов. Связывание с аллостерическим центром какой-либо молекулы (называемой активатором или ингибитором, а также эффектором, модулятором, регулятором) вызывает изменение конфигурации белка-фермента и, как следствие, скорости ферментативной реакции.

Аллостерические ферменты являются полимерными белками, активный и регуляторный центры находятся в разных субъединицах.

Вопрос 18-31.

Свойства ферментов как биокатализаторов:

1) Специфичность (избирательность) действия. Выделяют такие виды ее: а) абсолютная специфичность – фермент катализирует превращение только одного субстрата (один фермент – один субстрат). Пример – уреаза, аргиназа, сахараза, лактаза и др. б) стереоструктурная – фермент катализирует превращение определенного стереоизомера (лактатдегидрогеназа превращает только L-лактат) в) относительная – фермент катализирует превращение группы веществ с одним типом химической связи (один фермент – одна связь). Пример - пептидазы, эстеразы, гликозидазы.

2) Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры. Ферментативные реак- ции, как и все химические реакции, ускоряются при повышении температуры (в 2-4 раза на каждые 10оС). Однако скорость ферментативной реакции имеет свой температурный оптимум, превышение которого приводит к понижению активности ферментов из-за тепловой денатурации их молекул. Для большинства ферментативных реакций температурный оптимум - 38-40С, а при 50-60С и выше скорость ферментативных реакций сильно уменьшается из-за разрушения молекул фермента (искл. - миокиназа не инактивируется даже при 100 оС). Зависимость активности ферментов от температуры называется термолабильностью. Ферменты лучше сохраняются при низких температурах – их активность снижается, но денатурации не происходит. Это свойство используется в медицине для производства препаратов ферментов. При некоторых операциях необходимо снизить скорость обмена веществ. Тогда используют охлаждение органов (например, при пересадке почек, сердца и др. органов).

3) Зависимость ферментативной активности от рН среды. Каждый фермент имеет свой рН– оптимум - значение рН, при котором его активность максимальна. Фермент, как и любой белок, имеет в своей структуре ионогенные группы (например, карбоксильные группы или аминогруппы в боковых цепях), а от концентрация ионов водорода зависит их диссоциация и соотношение между положительно и отрицательно заряженными группами. Соотношение между этими группами определяет и пространственное строение молекулы фермента (его конформацию), а следовательно, и его активность. Большинство ферментов наиболее активны при рН=6-8. Исключения - пепсин (рНопт=1,5-2), аргиназа (рНопт=10-11).

4) Ферменты ускоряют как прямую так и обратную реакции (например, лактатдегидрогеназа)

5) Активность ферментов может изменяться под влиянием различных веществ, которые могут повышать (активаторы) или снижать (ингибиторы) скорость катализируемой реакции.

6) Ферменты в отличие от небиологических катализаторов проявляют более высокую актив- ность и проявляют свою способность ускорять реакции в очень маленьких концентрациях (например, одна молекула карбангидразы способна расщепить 36 млн. молекул Н2СO3).

7) Ферменты, как и небиологические катализаторы, катализируют только те реакции, которые подчиняются II закону термодинамики и являются энергетически возможными. Ферменты не входят в состав конечных продуктов реакции, не влияют на константу равновесия реакции, а только увеличивают скорость ее достижения.

Вопрос 32. Скорость ферментативной реакции зависит от концентрации субстрата [S] и количества присутствующего фермента. Эти величины определяют, сколько молекул фермента соединится с субстратом, и именно от содержания фермент-субстратного комплекса зависит скорость реакции, катализируемой данным ферментом.

Зависимость скорости (v) ферментативного превращения субстрата от его концентрации [S] описывается уравнением Михаэлиса – Ментен: где K_M – константа Михаэлиса, характеризующая активность фермента, V – максимальная скорость реакции при данной суммарной концентрации фермента. Из этого уравнения следует, что при малых [S] скорость реакции возрастает пропорционально концентрации субстрата. Однако при достаточно большом увеличении последней эта пропорциональность исчезает: скорость реакции перестает зависеть от [S] – наступает насыщение, когда все молекулы фермента оказываются занятыми субстратом.

Считается, что взаимодействие фермента и субстрата происходит по закону комплементарности. То есть конформация активного центра фермента должна соответствовать конфигурации субстрата (они подходят друг другу как ключ к замку). Позже была предложена теория «индуцированного» соответствия – замок формируется только в момент приближения субстрата к активному центру фермента. В процессе взаимодействия субстрата с ферментом выделяют 5 этапов: 1) присоединение фермента к субстрату и образование фермент-субстратного комплекса; 2) квантово–механические сдвиги, которые приводят к ослаблению связей; 3) разрыв или образование связей; 4) образование новых связей ведет к образованию продукта реакции, конфигурация которого уже не соответствует активному центру фермента; 5) освобождение продуктов реакции от фермента.

По закону действующих масс: Из этого закона следует, что при повышении концентрации субстрата автоматически повышается скорость ферментативной реакции.

Вопрос 37. Ингибиторы – вещества, которые уменьшают активность ферментов и замедляют химические реакции. Различают обратимое и необратимое ингибирование: Если ингибитор связывается с молекулой фермента слабыми связями (Е+И ↔ ЕИ) то такой ингибитор легко удаляется и активность фермента восстанавливается; Если ингибитор связывается с молекулой фермента прочными ковалентными связями (Е+И → ЕИ), то наступает необратимое подавление активности фермента. Необратимое ингибирование происходит при денатурация ферментов-белков под действием концентрированных кислот и щелочей, солей тяжелых металлов, ультрафиолетовом облучении. Обратимое ингибирование делится на конкурентное и неконкурентное. Конкурентное ингибирование вызывается веществами, структурно сходными с субстратом и взаимодействующими с активным центром фермента. Например, малоновая кислота, является конкурентным ингибитором сукцинатдегидрогеназы, поскольку похожа на янтарную кислоту (также имеет 2 карбоксильных группы). Поэтому, малоновая кислота легко связывается с активным центром сукцинатдегидрогеназы, вытесняя оттуда субстрат – янтарную кислоту. Однако, фермент неспособен это сделать с малоновой кислотой, которая короче на 1 атом углерода. Поэтому если прибавить малоновую кислоту в концентрации, превышающей концентрацию янтарной кислоты, то реакция прекратится, поскольку малонат заблокирует активный центр сукцинатдегидрогеназы.

Неконкурентные ингибиторы не имеют структурного сходства к субстрату и присоединяются не к активному центру, а к другим участкам, в том числе и к аллостерическому центру. Ингибирование происходит вследствие разрушения или необратимой химической модификации функциональных групп ферментов. Примеры: а) алкилирующие агенты (йодацетамид) необратимо реагируют с SН–группами ферментов Е–SH + I-CH2-CО-NH2 → E–S-CH2 –CО-NH2 + HI (фермент) (йодацетамид) комплекс фермент-ингибитор.

Вопрос 46. Ферменты располагаются в субклеточных структурах (органеллах) соответственно их функциям. Например: а) в ядре содержатся ферменты преобразования нуклеиновых кислот; б) во внутренней мембране митохондрий – ферменты дыхательной цепи; в) в лизосомах – гидролазы; г) в цитоплазме – ферменты гликолиза, синтеза жирных кислот; д) в матриксе митохондрий – ферменты ЦТК, окислительного декарбоксилирования α-кетокислот, β– окисления жирных кислот; е) плазматическая мембрана содержит ферменты транслоказы, которые переносят через мембрану ионы Nа+, К+, глюкозу, аминокислоты и т.д.

Вопрос 41. Принципы определения активности ферментов: - по скорости исчезновения субстрата; - по скорости накопления продуктов реакции. Единицы активности ферментов.1) За единицу активности фермента (U-unit, англ.) принимают такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля S (суб- страта) за 1 мин. при оптимальных условиях (1U= 1 мкмоль/мин.) 2) В системе СИ активность выражают в каталах: 1 катал – количество фермента, катали- зирующее превращение 1 моля S за 1 сек. при оптимальных условиях (1кат.=1 моль/с) 3) Удельная активность определяется количеством единиц ферментативной активности, которое приходится на 1 мг белка в биологическом объекте (U/мг белка).

Активаторы – вещества, которые повышают скорость ферментативных реакций, увеличивают активность ферментов. Они бывают органической и неорганической природы. Активаторы органической природы: желчные кислоты (активируют поджелудочную ли- пазу), энтерокиназа (активирует трипсиноген), глутатион, цистеин, витамин С (повышают активность оскидоредуктаз). Активаторы неорганической природы: например, HCl активирует пепсиноген, ионы ме- таллов (Na, Cl, K, Mg, Mn, Zn) активируют очень многие ферменты. Ионы металлов: а) спо- собствуют образованию фермент-субстратного комплекса; б) служат донорами и акцептора- ми электронов; в) принимают участие в образовании активного центра ферментов (Zn - в со- ставе карбангидразы, Fe – в составе цитохромов, каталазы, пероксидазы); г) выступают в ро- ли аллостерических регуляторов.

Мультиферментные комплексы это надмолекулярные образования которые включают, несколько ферментов и коферментов. Они катализируют последовательные этапы реакции преобразования одного субстрата. Примером мультиферментов являются реакции окисли- тельного декарбоксилирования α-кетокислот (пирувата и α-кетоглутарата) под влиянием пи- руватдегидрогеназы и α-кетоглутаратдегидрогеназы. Например пируватдегидрогеназный комплекс включает 3 фермента и использует 5 коферментов. Биологическое значение мультиферментных комплексов состоит в том, что благодаря их существованию облегчается перенос реагирующих веществ между отдельными фермен- тами и коферментами, что ускоряет протекание реакций. Мультиферментные комплексы, как правило, формируются на мембранах путем самосборки.

Изоферменты – это семейство ферментов, которые катализируют одну и ту же реакцию, но отличаются по строению и физико-химическим свойствам. Например: лактатдегидрогеназа (ЛДГ) состоит их 4 субъединиц 2х-типов: субъединица Н, выделенная из сердечной мышцы (heart – сердце), субъединица М, выделенная из скелетных мышц (musculus – мышца).

 

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: