 |
Реакции иммунного лизиса. Реакция связывания комплемента: ингредиенты, механизм, практическое применение.
|
|
|
|
Реакция иммунного лизиса.
В ходе реакции иммунного лизиса антитела образуют иммунные комплексы с поверхностными антигенами клетки (эритроцита в реакции гемолиза или бактерии в реакции бактериолиза), что приводит к активации на поверхности клетки комплемента и её комплементзависимому лизису.
Реакция гемолиза. Реакция гемолиза используется для определения титра и активности комплемента, а также как индикатор для оценки РСК; реакция локального гемолиза в геле носит название реакции Ерне.
Реакция Ерне. Используется для определения числа антителообразующих клеток в лимфоидных органах; в гель вносятся эритроциты, суспензия клеток исследуемой лимфоидной ткани и комплемент – число образующихся в результате реакции зон гемолиза равно числу клеток, секретирующих гемолизины.
Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), те происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело. Если же комплекс антиген - антитело не образуется, то комплемент остается свободным.
РСК проводят в две фазы 1 -я фаза - инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент, 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген - антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная).
|
|
|
64. Реакции твёрдофазного иммунологического анализа. Реакция иммунофлюоресценции, варианты. Иммуноферментный анализ: ингредиенты, механизмы. Иммуноблоттинг. Радиоиммунный анализ. Иммунная электронная микроскопия. Практическое применение РИФ, ИФА, РИА, ИЭМ.
Реакция иммунофлюоресценции - РИФ. Различают три разновидности метода прямой, непрямой, с комплементом. Является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител.
Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФИ люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.
Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью
антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела +антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном
микроскопе, как и при прямом методе.
Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого спектра диагностических наборов, быстротой получения ответа. Основным недостатком РИФ является ее субъективность.
|
|
|
Радиоиммунный анализ (РИА) - высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген - антитело с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом (125J, 14С, ЗН, 51Сг и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение). Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.
Иммуиоферментный анализ (ИФА) - выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазной и или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченой ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции - интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. Твердофазный ИФА - вариант теста, когда один из компонентов иммунной - реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или антигенов. При положительном результате изменяется цвет хромогена.
Достоинства ИФА: высокая чувствительность, позволяющая выявлять концентрации антигена до 10 пг/мл; высокая стандартность и воспроизводимость; возможность использовать минимальные объемы исследуемого материала; стабильность при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более); простота проведения реакции; наличие как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета; возможность автоматизации всех этапов реакции; относительно низкая стоимость диагностических наборов и оборудования.
Применение ИФА: диагностика инфекционных заболеваний: обнаружение антигенов возбудителя; обнаружение антител к антигенам возбудителя; мониторинг заболевания, определение ответа на терапию, прогноза развития заболевания и его исхода; контроль поствакцинального иммунитета; диагностика аутоиммунных заболеваний: определение аутоантител; диагностика аллергических заболеваний: определение общего и специфического IgE; определение продуктов активированных эозинофилов, базофилов и тучных клеток; диагностика злокачественных опухолей: определение в сыворотке маркеров опухолевого роста; фенотипирование опухолевых клеток (тканей) для уточнения происхождения и дифференцировки опухоли; определение концентрации гормонов, параметров менструально-овуляторного цикла; диагностика беременности; определение концентрации лекарственных препаратов; определение допинга; определение загрязнения окружающей среды.
|
|
|
Иммуноблоттинг – метод, позволяющий одновременно выявлять специфические антитела к спектру антигенов (к каждому из них) в сыворотке или другом материале. ИБ основан на тИФА; в отличие от тИФА в планшетах обладает большей специфичностью, но меньшей чувствительностью.
Этапы постановки ИБ:
1. Подготовка антигенов: лизис/дезинтеграция вирусов, бактерий; обработка додецил сульфатом натрия для придания всем компонентам схожего соотношения отрицательный заряд/молекулярная масса.
2. Получение блотов: разгонка антигенов в электрофорезе (пропорционально размеру);
перенос антигенов на мембрану;
разрезание мембраны на блоты (полоски, содержащие спектр антигенов).
3. Проведение реакции: обработка блота сывороткой больного (специфические антитела больного связываются с соответствующими антигенами);выявление связавшихся антител антивидовыми антителами к иммуноглобулинам человека, меченными ферментом;
внесение субстрата и проявление блотов (при связывании специфических антител в месте связывания образуется пятно);
4. Учет реакции (сравнение результата с положительным и отрицательным контролями) и выдача заключения.
ИБ применяют для: подтверждения результатов других серологических реакций; идентификации бактериальных или вирусных белков; идентификации микробов; научных целей.
Иммунная электронная микроскопия - электронная микроскопия микробов, чаще вирусов, обработанных соответствующими антителами. Вирусы, обработанные иммунной сывороткой, образуют иммунные агрегаты (микропреципитаты). Вокруг вирионов образуется "венцы" из антител, контрастированный фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими электроннооптически плотными препаратами.
|
|
|
65. Т-лимфоциты: развитие, маркёры, субпопуляции. Т-хелперы первого и второго типов, спектр продуцируемых цитокинов. Контроль иммунного ответа Т-лимфоцитами (Th3, T-регуляторы, CD4+CD25+). Методы определения количества и функциональной активности Т-лимфоцитов.
Т-лимфоциты представляют популяцию лимфоцитов, предшественники которых образуются в ККМ и затем мигрируют для дальнейшего созревания и дифференцировки в тимус.
Развитие:
1. Костный мозг. Образование Т-лимфоцитов (клетки экспрессируют CD34+-рецептор).
2. Выход в кровоток и движение в тимус (т.к. на поверхности имеются адресные молекулы к эндотелию сосудов коры тимуса).
3. Тимус (созревание и дифференцировка Т-лимфоцитов).
1) Тимические предшественники - наименее дифференцированные лимфоидные клетки тимуса (еще очень похожи на СКК). Экспрессируют: CD44 (рецептор хоминга в тимус), CD117 (рецептор СКК), IL-7R (рецептор выживания и размножения тимоцитов).
2) Ранние Т-лимфоциты. Начинает формироваться ТКР: происходит транскрипция β-цепи и перестройка γ -цепи. Являются дважды отрицательными клетками, поскольку не несут антигенов CD4 и CD8. Живут около 3 дней и только 30% их продолжает развитие.
3) Общие Т-лимфоциты. Экспрессия а-,β, γ -цепей TКР. Являются дважды положительными клетками (имеют антигены CD4 и CD8).
4) Зрелые Т-лимфоциты. Образуется две популяции единожды положительных клеток – одна популяция несет антиген CD4, другая - CD8.
Процесс «обучения» Т-лимфоцитов в тимусе:
«Положительная» селекция - «поддержка» клонов Т-лимфоцитов, рецепторы которых могут эффективно связываться с молекулами ГКГС на эпителиальных клетках коркового слоя тимуса. Такие клетки получают сигнал на выживание и размножение (ростовые факторы тимуса), остальные клетки погибают.
«Отрицательная» селекция - «выбраковка» аутореактивных клонов Т-лимфоцитов дендритными клетками в пограничной, корково-мозговой зоне тимуса. Клетки, реагирующие с “собственными” антигенами, уничтожаются путем апоптоза.
Итог: Более 99 % Т-лимфоцитов не выдерживают испытаний и погибают. Менее 1 % клеток превращается в зрелые формы, способные распознать в комплексе с ГКГС только чужеродные биополимеры.
4. Выход в кровоток и лимфатическую систему зрелых Т-лимфоцитов (дальнейшая дифференцировка).
Субпопуляции Т-лимфоцитов:
1. CD4+-клетки, рестриктированные по МНС II:
Т-хелперы. Выделяют Тх0, Тх1 и Тх2. Мишени: В- и Т-лимфоциты. Функция: секреция цитокинов.
|
|
|
Т-индукторы. Функция - взаимодействие с Тх, Тс, Тц, Мф, в отличие от Т-хелперов, которые взаимодействуют преимущественно с В-лимф. Функция: секреция цитокинов.
Т-эффекторы ГЗТ. Мишени: Мф, Тц, кл.Лангерганса. Функция - локализация инфекции.
2. CD8+-клетки,рестриктированные по МНС-I:
Т-цитотоксические лимфоциты. Это клетки-киллеры. Функция - уничтожение клеток, инфицированных вирусом, опухолевых клеток, и т.д.
Т-супрессоры. Функция - угнетение пролиферации других типов клеток.
3. CD4+ и CD8+-клетки,рестриктированные по МНС-I и МНС II:
Клетки-памяти. Маркер – CD4, CD8. Мишени: В- и Т-лимфоциты. Могут выживать в организме до 40 лет и более. Однако эффективный ответ на АГ сохраняется до10-15 лет.
Т- хелперы 1 типа. Индуцирующие антигены - АГ внутриклеточных МО (микобактерии, листерии, вирусы). АПК - дендритные клетки, макрофаги. Образуемые цитокины: ИЛ-2, ИЛ-12, ИФ-γ, ФНО. Формируемые реакции: клеточные реакции, противовирусный иммунитет, аутоиммунные реакции.
Т-хелперы 2 типа. Индуцирующие антигены - аллергены, АГ гельминтов, белковые антигены. АПК - В-лимфоциты, макрофаги, дендритные клетки. Образуемые цитокины: ИЛ- 4, 5, 6, 10, 13. Формируемые реакции: гуморальный иммунитет, аллергические реакции, иммунитет против паразитов.
Антигенные маркеры:
1. Молекулы контактного взаимодействия:
а) Адгезия: важна для выхода Т-лимфоцитов в ткани и удержания Т-клетки в контакте с АПК.CD2 - CD58;
б) Ко-стимуляция: необходима для получения Т-клеткой второго сигнала, без которого активация является неполной, а Т-клетка погибает от апоптоза. CD2; CD40 - CD40L; CD5 - CD72; CD24; CD28, CD80, CD86.
2. Корецепторы CD4, CD8: обеспечивают рестрикцию распознавания, усиливают сигнал о связывании антигена, маркеры функции лимфоцита.
|
|
|
