 |
Поверхностное культивирование
|
|
|
|
Этапы получения гибридом, синтезирующих моноклональные антитела.
1.Селекция миеломных клеток.
Для получения гибридом: В-лимфоциты и миеломные клетки выделяют из мышей и крыс.Клетки миеломы (плазмоцитомы)– это злокачественные трансформированные лимфоидные клетки костного мозга, представляющие собой клоны, образованные при делении единичных измененных опухолевых В-клеток, каждая из которых синтезирует моноклональные антитела неизвестной специфичности и обладает способностью к неограниченному размножениюinvivoиinvitro.
На практике чрезвычайно сложно получить миелому с заданной антигенной специфичностью, поэтому получают гибридные клетки-продуценты моноклональных антител, наследующие от миеломного партнера только способность к неограниченному размножению.
Клетки плазмоцитомы, используемые для гибридизации, получают путем мутагенеза.
2. Иммунизация мышей антигеном.
Схемы иммунизации, применяемые разными исследователями, значительно варьируются и определяются имеющимся типом и к-вом антигена. Иммунизация должна стимулировать формирование иммунного ответа и выраженное антителообразование.
Антиген вводят в/в, внутрибрюшно или подкожно с адъювантом (веществом, усиливающим иммуногенность антигенов) или без него в нарастающей дозе.При иммунизации животных иммунный ответ вырабатывается на все антигенные детерминанты всех компонентов вводимого материала.
Получение клеток селезенки (получение В-лимфоцитов).
В гуморальном иммунитете участвует преимущественно лимфоидная ткань селезенки, обеспечивая накопление большого количества плазматических клеток, синтезирующих антитела. Через 4 дня после последней инъекции антигена мышей убивают, извлекают селезенку, измельчают ее и готовят суспензию в специальной среде для культивирования, в состав которой входят аминокислоты, витамины, углеводы и неорганические соли. Эту взвесь используют для слияния. Суспензию клеток селезенки готовят при комнатной температуре.
|
|
|
4. Гибридизация (слияние) клеток миеломы и В-лимфоцитов селезенки.
Для проведения слияния используют полиэтиленгликоль (ПЭГ), который вызывает перераспределение мембранных белков, обеспечивая контакт и слияние клеток. В ПЭГ должны присутствовать ионы кальция, которые способствуют сближению клеток и образованию между ними кальциевых каналов.
5. Селекция гибридом на среде ГАТ.
Осадок клеток ресуспендируют в среде ГАТ, содержащей гипоксантин (Г), аминоптерин (А), тимидин (Т), разливают в лунки микропланшет и инкубируют при 37 °С в атмосфере диоксида углерод
Определение антителообразующей способности гибридом.
Идентификация клеток, синтезирующих антитела заданной специфичности очень важная процедура во всей гибридомной технологии. Новообразованные гибридомы могут быть нестабильными в отношении синтеза антител, поэтому методы раннего выявления отдельных антителообразующих клонов должны быть быстрыми и простыми
Клонирование гибридом.
Обнаруженные антителообразующие клоны должны быть немедленно реклонированы, необходимость этого обусловлена тем, что после слияния во многих гибридах начинается «выброс» хромосом
Вопрос № 72. Методы культивирования м/о:поверхностный, глубинный, проточный
Ферментация (культивирование)– это вся совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и термостатированную пит, среду посев, материала (инокулята) до завершения процессов роста и биосинтеза вследствие исчерпывания питательных веществ среды.
|
|
|
Способы промышленного культивирования м/о
· по содержанию кислорода (аэробные и анаэробные);
· по количеству ферментеров (одно-, дву- и многостадийные);
· по наличию или отсутствию перемешивания (динамические и статические);
· по физическому состоянию питательной среды (поверхностные и глубинные);
· по способу действия (периодический, непрерывный и промежуточные).
Поверхностное культивирование
-выращивании аэробных м/о на поверхности жидких и сыпучих пит, сред.
-м/о получают О из воздуха.
--при культивировании на жидких средах м/о растут в виде пленок.
-осущется в спец. ваннах - кюветах.
-может быть только периодическим
Сочетание пит, среды и растущих в ней м/о называют культуральной жидкостью.
Осуществляется глубинное культивирование в специальных аппаратах –ферментаторах,снабженных мешалками и системой подвода стерильного воздуха для обеспечения роста аэробных микроорганизмов
-более выгодный для пром, по сравнению с поверхностным способом, так как позволяет осуществлять полную механизацию и автоматизацию процесса, избегать инфицирования технологического процесса посторонней микрофлорой.
TEXHOЛОГИЯ ГЛУБИННОГО СПОСОБА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Технологический процесс глубинного выращивания микроорганизмов в реакторах складывается из следующих этапов:
1) подготовка реактора к посеву;
2) отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними;
3) приготовление матровой культуры для засева питательной среды;
4) посев матровой культуры в реактор с питательной средой для получения производственной расплодки микроорганизмов;
5) выращивание микроорганизмов и контроль за ходом процесса культивирования
Непрерывное (проточное) культивирование микроорганизмов.
-пришел в микробио из хим, технологии.
-имеют значительные преимущества перед периодическими: возможность специализации аппаратуры для каждой стадии непрерывного процесса, стабилизации его во времени, улучшение качества продукции, легкость регулировки и, главное, возможность автоматизации. Этими преимуществами объясняется тенденция в биотехнологии к переходу от периодических процессов к непрерывным.
|
|
|
-принцип состоит в том, что в сосуд, где размножаются м/о, непрерывно подается свежая пит, среда и одновременно втекает такой же объем культуры. По такому принципу организуются две разновидности тех. процесса непрерывного культивирования: процесс (технология) полного вытеснения и технология полного смещения.
Вопрос № 73. Особенности метода культуры изолированных тканей. Основные требования к выращиванию объектов в культуре in vitro асептика, качества питательных сред, физ.факторы
Методы выращивания изолированных тканей были разработаны Ф. Уайтом и Р. Готре. Сущность метода состоит по сути в том, что выделœенные кусочки ткани или отдельные клетки выращивают на искусственной питательной среде в стерильных условиях. В случае если полностью дифференцированную клетку изолировать, то в стерильных условиях на соответствующей питательной среде она снова начинает делиться и затем из нее может развиться целый растительный организм.
Методы выращивания изолированных тканей были разработаны Ф. Уайтом и Р. Готре. Сущность метода состоит по сути в том, что выделœенные кусочки ткани или отдельные клетки выращивают на искусственной питательной среде в стерильных условиях. В случае если полностью дифференцированную клетку изолировать, то в стерильных условиях на соответствующей питательной среде она снова начинает делиться и затем из нее может развиться целый растительный организм.
3.1. Асептика
Культивирование фрагментов ткани или органов растения (эксплантов) и
отдельных клеток требует соблюдения полной асептики. Микроорганизмы,
которые могут попасть в питательную среду, выделяют токсины,
ингибирующие рост клеток и приводящие культуру к гибели, поэтому
культивирование in vitro проводят в ламинар-боксе или в асептических
комнатах. В первом случае асептика достигается подачей профильтрованного
Культивирование фрагментов ткани или органов растения (эксплантов) и
отдельных клеток требует соблюдения полной асептики. Микроорганизмы,
|
|
|
которые могут попасть в питательную среду, выделяют токсины,
ингибирующие рост клеток и приводящие культуру к гибели, поэтому
культивирование in vitro проводят в ламинар-боксе или в асептических
комнатах. В первом случае асептика достигается подачей профильтрованного
необходимы в качестве питательного компонента, так как большинство
каллусных тканей лишено хлорофилла и неспособно к автотрофному питанию.
Поэтому их выращивают в условиях рассеянного освещения или в темноте.
Исключение составляет каллусная ткань мандрагоры, амаранта и некоторых
других растений.
Питательные среды
Изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных
питательных средах. Они отличаются по составу, но, в состав всех сред входят
необходимые растениям макро- и микроэлементы, углеводы, витамины,
фитогормоны и их синтетические аналоги.
Обязательными компонентами питательных сред должны быть ауксины,
вызывающие дедифферинцировку клеток экспланта и цитокинины,
индуцирующие клеточные деления. При изменении соотношения между этими
фитогормонами и при добавлении других фитогормонов могут быть вызваны
разные типы морфогенеза.
3.3. Физические факторы
На рост и развитие растительных тканей in vitro большое влияние
оказывают физические факторы – свет, температура, аэрация, влажность.
Большинство каллусных тканей могут расти в условиях слабого
освещения или в темноте, так как они не способны фотосинтезировать. Вместе
с тем свет может выступать как фактор, обеспечивающий морфогенез и
активирующий процессы вторичного синтеза. В качестве источника света
используют люминесцентные лампы. Для большинства травянистых растений
Для большинства каллусных культур оптимальна температура 26о
С, но
каллусы и культуры клеток диоскореи дельтавидной хорошо растут даже при
температуре 32о
С. В отличие от роста культур клеток и тканей индукция их
Для выращивания суспензионных культур большое значение имеет
аэрация. Особенно важно снабжение воздухом культивируемых клеток в
больших объемах ферментеров. При сравнении разных типов ферментеров
было показано, что синтез вторичных метаболитов в суспензионной культуре
был наибольшим при подаче воздуха снизу. При выращивании клеток в малых
объемах (в колбах) нормальная аэрация достигается при постоянном
перемешивании суспензии. Оптимальная влажность в помещении, где растут
культуры, должна составлять 60–70%.
|
|
|
