 |
Эксклюзионная хроматография.
|
|
|
|
Реферат
Тема: Хроматография. Роль хроматографии в медико-биологических исследованиях.
Выполнила студентка
Гр. Д-106
Рытвинская Виктория Ивановна
Проверил преподаватель: Перминова Е.А.
Гомель 2016
Оглавление
Введение…………………………………………………………………………3
Из истории хроматографии……………..……………………………………4-5
Виды жидкостной хроматографии.................................................................6-8
Эксклюзионная хроматография………………………………………….9-10
Афинная, или биоспецифическая, хроматография…………………….11-12
Разделение оптически активных соединений………………………...…13-14
Заключение…………………………………………………………………..….15
Список литературы………………………………………………………….....16
Введение
Хроматография как эффективный метод разделения и исследования состава сложных многокомпонентных смесей родилась в начале ХХ века и к настоящему времени сформировалась в самостоятельную научную дисциплину, изучающую распределение химических соединений в системе двух контактирующих несмешивающихся фаз, из которых, как правило, одна - подвижная, перемещается относительно другой - неподвижной [1].
Химики, экологи, медики, криминалисты в настоящее время не могут обойтись без применения в своей работе хроматографических методов, используемых для ранней диагностики заболеваний, изучения метаболизма лекарств и пищевых продуктов. Анализ компонентов запахов, органических загрязнителей в атмосфере городов, допинговый контроль на спортивных олимпиадах, поиск психотропных веществ в организме человека - все это под силу хроматографии. В последние годы разработаны специальные методики хроматографического анализа содержимого одной клетки, методики для расшифровки компонентов ДНК (международный проект "Геном человека").
|
|
|
Из истории хроматографии.
Рождение хроматографического метода анализа связывают с именем русского ботаника Михаила Семеновича Цвета (1872-1919), который в 1902-1903 годах после серии предварительных экспериментов достиг разделения сложной смеси растительных пигментов при пропускании петролейно-эфирной вытяжки из листьев растений через стеклянную колонку, заполненную порошкообразным карбонатом кальция.
В чем же суть эксперимента, поставленного ученым? В стеклянную трубку с сорбентом М.С. Цвет вносил некоторое количество спиртовой вытяжки красящих пигментов зеленых листьев. Верхняя часть сорбента, находящегося в стеклянной колонке, приобретала интенсивно зеленый цвет. Затем через колонку Цвет пропускал подвижную фазу. Растворяясь в ней, компоненты исследуемой смеси экстрагируются и продвигаются по колонке, сорбируясь новыми порциями сорбента. Вещества различной химической природы перемещаются по слою сорбента с разными скоростями за счет различного распределения компонентов анализируемой смеси между подвижной и неподвижной фазами, образовав в итоге четко разделенные окрашенные зоны (рис. 1). Цвет отмечал: "Если петролейно-эфирный раствор хлорофилла профильтровать через столбик адсорбента_, то пигменты по расположению их в адсорбционном ряду отличаются отдельными окрашенными зонами_ Получаемый таким образом препарат я называю хроматограммой, а предлагаемую методику - хроматографической". Так впервые прозвучало слово "хроматография" (от греч. хроматос - цвет, окраска и графио - пишу, описываю). Если подвижная фаза - жидкость, говорят о жидкостной хроматографии.
Изменяя природу растворителя, оказалось возможным регулировать степень распределения зон по слою адсорбента: сдвигать или раздвигать их, способствуя большей селективности анализа. Таким образом, характер распределения разделяемых соединений между подвижной фазой (элюентом) и неподвижной (адсорбентом) определяется природой всех участников хроматографического процесса. Не оцененные современниками исследования М.С. Цвета послужили мощным стимулом к дальнейшему развитию хроматографии на протяжении XX века.
|
|
|
Заметной вехой явилось создание в 1938 году варианта тонкослойной хроматографии. Советские химики Н.А. Измайлов и М.С. Шрайбер осуществили разделение веществ природного происхождения, используя хроматографическую систему, где сорбент был помещен не в колонку, а распределен в виде тонкого слоя на стеклянной пластинке ("открытая колонка"). Объектами служили белладонна, красный перец, строфантин, валериана. Растворы анализируемых образцов стеклянным капилляром наносили на стартовую линию пластины, затем пластинку помещали в специальную камеру с подвижной фазой [3].
Середина 70-х годов XX века ознаменована рождением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Появились первые жидкостные хроматографы. Блок-схема такого прибора представлена на рис. 2. Жидкостная хроматография (ЖХ) в ее классическом варианте (при атмосферном давлении) и высокоскоростная, или ВЭЖХ при повышенном давлении - оптимальный метод анализа химически и термически нестойких молекул, высокомолекулярных веществ с пониженной летучестью, что объясняется особой ролью подвижной фазы: в отличие от газообразной элюент в ЖХ выполняет не только транспортную функцию. Природа и строение компонентов подвижной фазы контролируют хроматографическое поведение разделяемых веществ. Среди наиболее типичных объектов жидкостной хроматографии белки, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, красители, полисахариды, взрывчатые вещества, лекарственные препараты, метаболиты растений и животных.
Виды жидкостной хроматографии.
Жидкостная хроматография, в свою очередь, разделяется на жидкостно-адсорбционную (разделение соединений происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с поверхности адсорбента), жидкостно-жидкостную, или распределительную (разделение осуществляется за счет различной растворимости в подвижной фазе - элюенте и неподвижной фазе, физически сорбированной или химически привитой к поверхности твердого адсорбента), ионообменную хроматографию, где разделение достигается за счет обратимого взаимодействия анализируемых ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента - ионита. Ионообменная хроматография наряду с другими областями ее использования играет большую роль в производстве антибиотиков: стрептомицина, тетрациклина, синтетического пенициллина.
|
|
|
В основу одной из разновидностей ЖХ - ион-парной (ИПХ) положены принципы классической экстракции ионных веществ из водной в органическую фазу в виде ионных пар. Для этого в подвижную фазу добавляется противоион, способный вступать в селективное комплексообразование с анализируемыми компонентами с образованием ионной пары. Основные преимущества такого варианта заключаются в том, что одновременно могут быть проанализированы вещества кислотного, основного и нейтрального характера.
При выборе условий разделения необходимо учитывать молекулярную массу компонентов образца, их полярность и природу сопутствующих соединений. Если молекулярная масса превышает 2000 у.е., то обычно обращаются к методу эксклюзионной, или гель-хроматографии. Во всех остальных случаях решение задачи разделения многокомпонентной смеси возможно в принципе осуществить методами адсорбционной или распределительной ЖХ в нормально- или обращенно-фазовом варианте (ОФ). Нормально-фазовый режим предпочтителен, если анализируемые вещества содержат различные функциональные группы. При этом имеют значение количество функциональных групп, способность анализируемых соединений к образованию водородных связей, строение (например, цис-трансизомерия). Если вещества обладают слабым сродством к подвижной фазе, то используют активные слои сорбента и слабо полярные растворители. К ОФ-хроматографии прибегают при разделении гомологов, сильно полярных веществ, анализ которых на полярных сорбентах неэффективен, а также соединений, сродство которых к полярной неподвижной фазе незначительно.
|
|
|
По оценкам авторитетных специалистов, 70% хроматографических анализов проводят методом ОФ ВЭЖХ; разработаны и внедрены сорбенты на основе силикагеля с химически привитыми алкильными радикалами. Чаще всего применяют сорбенты с С8- и С18-группами, стабильные в водных растворах в интервале рН 2-8. Этим объясняется их эффективное использование при анализе биологических объектов. Методом ОФ ВЭЖХ осуществляется определение важнейших нейромедиаторов (от лат. mediator - посредник; медиаторы передают информацию в живом организме, меняя ионную проницаемость наружных клеточных мембран) в плазме крови, спинномозговой жидкости, что имеет большое значение для диагностики различных заболеваний мозга (паркинсонизм, эпилепсия, шизофрения, болезнь Альцгеймера). Времена выхода компонентов, отсчитываемые от момента ввода пробы до регистрации вершины хроматографического пика, или, иначе, объемы подвижной фазы, затраченные на перенос через колонку каждого компонента, дают качественную характеристику анализируемых веществ (рис. 3). Сопоставление площадей (или высот) хроматографических пиков позволяет выполнять количественные определения.
Особое место в использовании методов жидкостной хроматографии в медицине занимают эксклюзионная, или гель-хроматография и аффинная, или биоспецифическая.
Эксклюзионная хроматография.
В основе этого варианта ЖХ лежит принцип разделения смеси веществ по их молекулярным массам. В эксклюзионной (от англ. exclusion - исключение; устаревшее название - ситовая) хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счет их различной способности проникать в поры сорбента. Подвижная фаза - жидкость, а неподвижная - та же жидкость, заполнившая поры сорбента (геля). Если молекулам анализируемого вещества недоступны эти поры, то соответствующее соединение выйдет из колонки раньше, чем то, у которого размеры молекул меньше. Молекулы или ионы, размеры которых находятся между максимальным и минимальным диаметром пор геля, разделяются на отдельные зоны. С помощью этого вида хроматографии в Институте вирусологии в Москве в 1990 году был выделен вирус СПИДа.
Особенно интенсивное развитие эксклюзионная хроматография получила в последние два десятилетия, чему способствовало внедрение в химическую и биохимическую практику сефадексов - декстрановых гелей, поперечно сшитых эпихлоргидрином. На различных типах сефадексов можно фракционировать химические вещества с различными молекулярными массами, поэтому их широко используют для выделения и очистки биополимеров, пептидов, олиго- и полисахаридов, нуклеиновых кислот и даже клеток (лимфоцитов, эритроцитов), в промышленном производстве различных белковых препаратов, в частности ферментов и гормонов. Были не только выделены и исследованы ранее неизученные белки, но и получена информация, заставившая пересмотреть некоторые традиционные представления. Так, при гель-фильтрации образцов плазмы крови животных и человека оказалось, что ростовые вещества выходят из колонки в основном не тогда, когда их ожидают согласно молекулярной массе (6-8 тыс. дальтон), а значительно раньше, то есть в одной фракции с высокомолекулярными белками. Выяснилось, что крупные пептиды, подобно низкомолекулярным веществам, могут циркулировать в крови в комплексе с белком-носителем. Это явление имеет важное физиологическое значение, и нарушение по каким-либо причинам биосинтеза белка-носителя приводит к серьезным патологиям.
|
|
|
9
Сообщалось еще об одном интересном явлении, связанном с белковыми гормонами и обнаруженном в режиме эксклюзионной хроматографии. Установлено, что мономер гормона соматотропина (гормон роста), белка с молекулярной массой 21 тыс. дальтон, через несколько минут после его введения человеку или животному перераспределяется в крови по белковым фракциям с молекулярной массой вплоть до 100 тыс. дальтон. Причиной могут быть связывание его с каким-либо транспортным белком или собственная агрегация. Для другого гормона - кортикотропина, регулирующего функции надпочечников, перераспределение по фракциям сопровождается изменением биологической активности. Все это удалось выяснить благодаря гель-хроматографии.
|
|
|
