 |
Определение активности щелочной и кислой фосфатаз в сыворотке крови по гидролизу бета-глицерофосфата (метод Бодански).
|
|
|
|
Тема: Принципы и методы диагностической энзимологии
Цель занятия: Сформировать у студентов представление об энзимодиагностике, ее преимуществах, возможностях и использовании в современном диагностическом процессе.
Исходный уровень знаний и навыков
Студент должен знать:
1 Общую организацию структуры клетки. Строение и функции органелл.
2 Органную локализацию метаболических процессов. Маркерные и органоспецифические ферменты.
3 Множественные формы ферментов и изоферменты.
4 Факторы, влияющие на активность ферментов.
5 Основные методы биохимии, использующиеся в энзимологии.
6 Систему СИ. Понятие нормы и достоверности полученных данных.
7 Состав крови и других биологических жидкостей.
8 Кинетику взаимодействия лигандов с макромолекулами.
Студент должен уметь:
1. Определять оптическую плотность растворов на абсорбционном фотометре.
2. Определять содержание вещества в растворе методом титрования.
3. Интерпретировать полученные данные активности ферментов в биологических жидкостях.
Структура занятия
I. Теоретическая часть
1. Энзимодиагностика как направление медицинской энзимологии. Значение для врача.
2. Объекты энзимодиагностики (плазма крови, моча, лимфа, цереброспинальная, слезная, синовиальная, перитониальная, лаважная бронхоальвеолярная, серозная, амниотическая, семенная жидкости, желчь, пищеварительные соки, отделяемое женских половых органов, пот, кал, мокрота, экссудаты и транссудаты, клетки и биоптаты). Принципы взятия, хранения и доставки биоматериала. Факторы, влияющие на результаты анализа.
3. Основные ферменты, использующиеся для энзимодиагностики: биохимическая роль, методы определения, клинико-диагностическое значение исследования (ЛДГ, АЛТ, АСТ, фосфатазы, амилаза, транскетолаза, ГДГ, сорбитолДГ, ГГТП, ХЭ, КФК, глицинамидинотрансфераза и др.).
|
|
|
4. Ферментные тесты при патологических и физиологических состояниях.
4.1 Сердечно-сосудистая система и скелетная мускулатура (острый инфаркт миокарда, стенокардия, миозит, механическое повреждение мышц, миопатии);
4.2 Печень, желчевыводящие пути и пищеварительный тракт (острые и хронические гепатиты, цирроз, холестаз, инфильтративные заболевания, панкреатит, эпидемический паротит, язвенные поражения);
4.3 Костная система;
4.4 Система крови и кроветворения (патологии эритроцитов, анемия, лейкемия);
4.5 Почки и мочевыводящая система (почечная недостаточность, пиелонефрит, гломерулонефрит);
4.6 Опухолевый рост;
4.7 Беременность.
5. Основные методы, использующиеся при определении активности ферментов.
5.1 По типу аналитического сигнала (а) оптические методы: оптический тест Варбурга, абсорбционная фотометрия, эмиссионный анализ; б) титриметрические методы объемного анализа: кислотно-основное, кондуктометрическое титрование; в) цито– и гистохимия, метод «сухой» химии (тест-полоски);
5.2 По методологии анализа (метод конечной точки, кинетический метод – метод непрерывной регистрации).
6. Единицы измерения активности ферментов: катал, МЕ (IU), каталитическая концентрация, удельная активность, молекулярная активность.
II. Практическая часть
1. Инструктаж по технике безопасности (проводится по соответствующим инструкциям ПБ и ТБ).
2. Решение задач.
3. Лабораторные работы.
4. Проведение контроля конечного уровня знаний.
Задачи
1. Для чего используется количественное определение активности ферментов в тканях и биологических жидкостях?
а. Для диагностики заболеваний, связанных с нарушениями функционирования ферментов.
|
|
|
б. При приготовлении ферментных препаратов, используемых в качестве лекарств.
в. Для контроля эффективности лечения ряда заболеваний.
г. Для оценки эффективности лекарственных препаратов, действующих на ферменты-мишени.
2. Какие требования предъявляют к ферментам, которые можно использовать в целях энзимодиагностики?
а. Органоспепифичность ферментов.
б. Выход ферментов в кровь при повреждении органов.
в. Низкая, активность или полное отсутствие ферментов в сыворотке крови в норме.
г. Высокая стабильность ферментов.
3. Объясните биохимический смысл некоторых требований (подчеркнуты), предъявляемых к хранению и использованию ферментных препаратов.
а. Растворение сухого препарата дистиллированно й водой комнатной температуры.
б. При растворении препарата перемешивать осторожно, не допуская образования пены.
в. Хранение раствора препарата при низкой температуре.
г. При необходимости длительного хранения высушивание препарата и запаивание в вакуумированные ампулы.
4. Печень крысы гомогенизировали, затем фракционировали на субклеточные фракции путем дифференциального центрифугирования. В каждой фракции определяли активность гистидазы - фермента, катализирующего отщепление аминогруппы от гистидина. Условия для определения активности фермента даны в таблице. Определите локализацию гистидазы.
| Условия опыта | Субклеточные фракции | |||
| Ядерная | Митохондриальная | Микросомная | Клеточный сок | |
| 1. Количество превращенного субстрата (в мкмоль на пробу) 2. Время инкубации фермента с субстратом (в мин) 3. Объем пробы (в мл) 4. Концентрация белка (в мг/мл) | 0,5 2,5 | 1,0 3,2 | 2,0 0,8 | 0,4 0,8 |
5. Препарат, содержащий 2,0 мг аргиназы, за 10 мин при t = 38°С и рН 9,0 катализировал образование 30 мкмоль мочевины. Рассчитайте удельную активность аргиназы. Объясните, как и почему изменится (↓ - уменьшится, ↑ - увеличится) активность фермента, если:
а) инкубационную среду подкислить до рН 5,0;
б) в среду добавить гликоциамин
(NH2-С- NН-СН2-СООН);
││
NH
в) в присутствии гликоциамина увеличить в среде концентрацию аргинина.
6. Холинэстераза при оптимальных условиях (рН 8,4 и t = 37°С) в течение 15 мин катализирует гидролиз ацетилхолина с образованием 100 ммоль холина и уксусной кислоты. Рассчитайте активность фермента. Объясните, как и почему изменится (↓ или ↑) активность фермента, если:
|
|
|
а) температуру инкубационной среды изменить от 5 до 40°С;
б) в инкубационную среду добавить прозерин;
в) в присутствии прозерина повышать концентрацию ацетилхолина.
7. 0,05 мг трипсина за 15 мин образуют 100 мкмоль тирозина при оптимальных условиях инкубации: рН 8,0 и 37°С. Рассчитайте удельную активность трипсина. Объясните, как и почему изменится активность трипсина, если:
а) рН инкубационной среды снизить до 3,0;
б) температуру инкубационной среды повысить до t = 78°С;
в) в инкубационную среду добавить трасилол (полипептид).
8. 1 мг фермента сукцинатдегидрогеназы за 5 мин катализирует окисление янтарной кислоты с образованием 10 мкмоль фумаровой при 37°С и рН 7,0. Рассчитайте удельную активность фермента в оптимальных условиях. Объясните, как и почему изменится активность фермента, если:
а) рН инкубационной смеси снизить до 4,0;
б) к среде добавить малоновую кислоту;
в) в присутствии малоновой кислоты увеличить концентрацию янтарной кислоты.
9. 5 мг фермента лактатдегидрогеназы за 30 мин катализируют превращение пирувата с образованием 20 мкмоль лактата при 37°С и рН 7,4. Рассчитайте удельную активность фермента в оптимальных условиях. Объясните, как и почему изменится активность фермента, если:
а) рН инкубационной смеси увеличить до 10,0;
б) снизить концентрацию НАД+.
10. В клетках печени человека обнаружена высокая активностьаминотрансфераз (аланиновой - АЛТ и аспарагиновой - АСТ).
АЛТ
Ала + a-кетоглутарат → Глу + пируват.
АСТ
Асп + α-кетоглутарат→ Глу + оксалоацетат.
АЛТ локализована лишь в цитоплазме, АСТ на 1/3 - в митохондриях, на 2/3 - в цитоплазме.
Некротические процессы в тканях (разрушение всех клеточных структур) сопровождаются выходом в кровь всех внутриклеточных ферментов. При воспалительных процессах повышается проницаемость клеточных мембран, и в крови могут обнаруживаться цитоплазматические ферменты.
В таблице приведено распределение активности аминотрансфераз в клетках печени и крови, выраженное в условных единицах.
|
|
|
| Органы ткани | АСТ (условные единицы) | АЛТ (условные единицы) | ||
| цитоплазма | митохондрии | цитоплазма | митохондрии | |
| Печень | - | |||
| Кровь | - | - |
Определите, каково будет соотношение активности АСТ/АЛТ при остром инфекционном гепатите с некротическими явлениями.
11. Мужчина 52 лет обратился к врачу с жалобами на продолжительные загрудинные боли, удушье. Предварительный диагноз — «инфаркт миокарда».Какие специфические биохимические тесты необходимо провести для подтверждения диагноза?
12. При биохимическом исследовании крови обнаружили резкое повышение активности ЛДГ, АСТ и АЛТ. Коэффициент де Ритиса равен 3,85.
а) Какое заболевание можно предположить у обследуемого?
б) Активность еще какого фермента в сыворотке крови будет повышена?
13. Больной поступил в клинику с диагнозом «острый панкреатит». Активность каких ферментов в сыворотке крови будет повышена по сравнению снормой:
а) АЛТ;
б) α-Амилазы;
в) ЛДГ;
г) ГДГ;
д) панкреатической липазы.
14. При биохимическом исследовании крови больного получили следующие результаты:
Фермент Активность, Е/л
ЩФ 800
АЛТ 45
АСТ 33
Нарушение функции какого органа можно предположить у обследованного?
15. У больного 62 лет предварительный диагноз «рак предстательной железы». Активность кислой фосфатазы в крови выше нормы.
а) Какой еще биохимический анализ нужно провести для уточнения диагноза?
б) Какие результаты анализа подтвердят диагноз?
Лабораторные работы
Лабораторная работа № 1.
Определение активности щелочной и кислой фосфатаз в сыворотке крови по гидролизу бета-глицерофосфата (метод Бодански).
Принцип метода. Под действием фермента сыворотки крови бета-глицерофосфат натрия подвергается гидролизу с освобождением неорганического фосфора, по содержанию которого и судят об активности данного энзима.
Ход работы. В 4 пробирки (2 опытные — для исследования активности щелочной и кислой фосфатаз и 2 контрольные — для установления содержания в сыворотке неорганического фосфора) приливают по 1 мл соответствующего (щелочного и кислого) раствора бета-глицерофосфата. Первые 2 пробирки на несколько минут помещают в водяную баню или термостат (37°С) с целью прогревания раствора субстрата. Затем осторожно, избегая образования пузырьков воздуха, в пробирки вносят по 0,1 мл свежевзятой сыворотки и полученную фермент-субстратную смесь инкубируют в течение 1 ч при температуре 37°С. Учитывая, что активность кислой фосфатазы в «нормальной» крови обычно весьма незначительна, иногда гидролиз соответствующей пробы проводят три часа; цифру, выражающую результат, делят на 3.
|
|
|
Время термостатирования опытных проб может быть использовано для определения содержания неорганического фосфора в контрольных пробах. Для этого к 1 мл щелочного (или кислого) раствора бета-глицерофосфата приливают 1,1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, после чего добавляют 0,1 мл той же сыворотки; пробы взбалтывают и через несколько минут фильтруют или центрифугируют.
К 1,5 мл отобранного фильтрата (центрифугата) доливают 1 мл молибденового раствора, 1 мл раствора аскорбиновой кислоты, пробы выдерживают в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего фотометрируют в красной области спектра, например, на ФЭКе с красным светофильтром в кювете с шириной слоя 5 мм. При учете оптической плотности проб в качестве раствора для сравнения используют дистиллированную воду (вместо нее лучше ставить пробу на реактивы, содержащую бета-глицерофосфат).
Рассчитывают активность щелочной и кислой фосфатаз по калибровочной кривой.
Активность фосфатазы ранее выражали количеством мг неорганического фосфора, образующегося в результате деятельности всей фосфатазы, заключенной в 100 мл сыворотки (единицы Бодански). Для этого по калибровочной кривой находили уровень неорганического фосфора в опытных (Опщ и Опк) и контрольных (Кщ и Кк) пробах. Затем, вычтя из показателей содержания неорганического фосфора в опытных пробах содержание его в контрольных пробах, определяли количество фосфора (мг), которое освободилось при деятельности фосфатазы, заключенной в 0,1 мл сыворотки. Очевидно, что под влиянием ферментативной активности фосфатазы, содержащейся в 100 мл сыворотки, неорганического фосфора выделилось бы в 1000 раз больше.
Отсюда активность щелочной (1) и кислой (2) фосфатаз рассчитывают по следующим формулам:
(Опщ - Кщ) • 1000 = а ед. Бодански (1), (Опк - Кк) • 1000 = а ед. Бодански (2),
где Опщ, Опк (Кщ, Кк) — количество неорганического фосфора, содержащегося в опытных (и контрольных) пробах, 1000 — коэффициент пересчета, а — количество единиц Бодански (ВЕ).
В норме активность щелочной фосфатазы в сыворотке взрослых людей составляет 2—5 ед, у детей — 5—12 ед Бодански. Активность кислой фосфатазы в сыворотке крови взрослых и детей колеблется в пределах от 0,1 до 0,55 ед Бодански.
Приведенный способ выражения активности фосфатаз (в ед Бодански) является устаревшим. В соответствии с требованиями используемой в клинико-лабораторной практике Международной системы единиц активность этих ферментов следует оценивать по количеству выделенного неорганического фосфора (в ммоль) при действии на субстрат 1 л сыворотки за время инкубации 1 ч при +37°С. Пересчет производится по формуле:
а • 474,19.
В норме активность щелочной фосфатазы составляет у взрослых 0,5—1,3 ммоль/(ч*л), кислой фосфатазы — 0,05—0,13 ммоль/(ч*л).
Примечание: не рекомендуется брать кровь для анализа активности кислой фосфатазы в течение 24 ч после массажа простаты или ее инструментального исследования.
Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.
Клинико-диагностическое значение определения активности фосфатаз
Повышение активности щелочной фосфатазы в крови происходит главным образом при двух видах патологии: костных заболеваниях, связанных с пролиферацией остеобластов, и болезнях, сопровождающихся явлениями холестаза.
Путем определения активности щелочной фосфатазы удается выявить скрытые формы рахита, а при систематическом обследовании детей — и предрахитические стадии заболевания. Повышение активности фосфатаз в данном случае надо рассматривать как компенсаторный механизм обеспечения потребностей организма в неорганических фосфатах.
У больных с опухолями костей без новообразований костной ткани (остеомы, хондромы, гигантоклеточная опухоль, множественная миелома и др.) активность щелочной фосфатазы не изменяется. Не повышается активность фермента в крови также при деструктивном характере повреждения костей.
Метастазирование опухолей в кости приводит к возрастанию активности щелочной фосфатазы сыворотки крови. Но еще больший подъем активности фермента наблюдается при метастазировании в печень.
Повышение активности ЩФ происходит не только в условиях интенсивного роста костной ткани, но и при ее разрушении: остеопорозе и последующей остеомаляции. Прямое подтверждение этого процесса, к сожалению, возможно только путем биопсии костной ткани. При тяжелом остеопорозе, остеомаляции активность ЩФ в сыворотке крови может быть нормальной или слабоповышенной (в 2—3 раза). Остеомаляция, верифицированная гистологически, может протекать при нормальной активности ЩФ.
Активность ЩФ в сыворотке крови бывает повышена при остеомиодистрофии, развивающейся как осложнение длительного гемодиализа.
У пациентов с болезнью Педжета отмечена достоверная корреляция активности ЩФ и степени поражения скелета. При остеопорозе показана прямая зависимость активности ЩФ крови и экскреции с мочой оксипролина. В этих условиях определение активности ЩФ сыворотки крови можно использовать для оценки эффективности терапии кальцитонином и фосфатами.
При заболеваниях печени, сопровождающихся повреждением паренхимы и острым клеточным некрозом печени (вирусный гепатит, саркоидоз, туберкулез, амилоидоз и лимфогранулематоз, инфекционный мононуклеоз), отмечается умеренное возрастание активности ЩФ. Особенно резкое повышение ее активности встречается при желтой атрофии, абсцессах печени, а также поражениях печени, вызванных некоторыми лекарственными веществами: хлорпромазином, метилтестостероном.
Увеличивается активность щелочной фосфатазы также при обтурационной (механической) желтухе, возникшей вследствие закупорки внутри- и внепеченочных желчных протоков камнем, спайками, опухолью (рак гепатодуоденальной зоны). Кроме освобождения печеночного изофермента ЩФ, холестаз обусловливает также попадание желчного фермента в плазму крови через синусоиды, а также вследствие активации фермента в желчных канальцах. Этим комбинированным эффектом и объясняется высокая чувствительность щелочной фосфатазы к закупорке желчных путей.
Возрастание активности фермента часто наблюдается при холангите и холангиолите, хроническом холецистите.
Исследование активности ЩФ оказывается полезным и в дифференциальной диагностике внутри- и внепеченочного холестаза. В случае экстрагепатобилиарной обструкции при камнях желчного протока и желчного пузыря, а также при новообразованиях в этих органах активность ЩФ повышается в 10 раз и более. Внутрипеченочная обструкция желчных путей при гепатите также сопровождается повышением активности ЩФ, но степень гиперферментемии не превышает 2—3-кратного значения. Острые некротические изменения гепатоцитов могут не сопровождаться повышением активности ЩФ до тех пор, пока в патологический процесс не будут вовлечены желчные канальцы и не будет происходить задержка желчеотделения. В то же время далеко не во всех случаях поражения паренхимы печени имеется четкая корреляционная зависимость между активностью ЩФ сыворотки крови и содержанием в ней билирубина. В начале развития внутрипеченочного стаза повышение активности ЩФ может быть следствием усиления синтеза белка в гепатоцитах; последующее возрастание активности ЩФ в сыворотке крови, особенно в форме макро-ЩФ, связано с нарушением целостности клеток желчных канальцев.
ЩФ высокой молекулярной массы, присутствующая в сыворотке крови больных внутри- и внепеченочным холестазом, представляет собой комплекс фермента с фрагментами плазматической мембраны гепатоцитов, составляющих синусоидальную зону печени. Методом электронной микроскопии установлено, что ЩФ в крови больных, страдающих холестазом, представляет собой везикулы трехслойной структуры. Помимо ЩФ, эти фрагменты плазматической мембраны содержат и другие мембрано-связанные ферменты — гамма-глутамилтранспептидазу, лейцин-аминопептидазу, 5-нуклеотидазу. Специфичный для холестаза липопротеин, названный ЛП-Х, рассматривается как специфичный тест холестаза.
Ассоциация фермента ЩФ с ЛП-Х дала основание назвать такой комплекс холестатическим, хотя более правильно для ЩФ высокой молекулярной массы оставить термин «мембраносвязанный комплекс ЩФ». Он является более чувствительным индикатором ранних сроков холестаза по сравнению с другими тестами.
Повышение активности ЩФ в сыворотке крови отмечено более чем у 30% больных ревматоидным артритом, однако не найдено корреляции общей активности ЩФ с длительностью заболевания, возрастом, полом и скоростью седиментации эритроцитов. Более высокая по сравнению с нормой активность ЩФ выявлена при ревматоидных васкулитах, гранулематозах и полиартрите, что связывают с вовлечением в процесс гепатобилиарной системы. Тем не менее повышение активности печеночного изофермента ЩФ при ревматизме не связано со степенью тяжести патологического процесса. Следует принять во внимание, что даже терапевтическая доза противовоспалительных препаратов, например салицилатов, приводит к повышению активности аминотрансфераз и ЩФ в сыворотке крови. Изучение спектра изоферментов ЩФ при ревматизме показало, что повышение активности «костного» изофермента в более высокой степени, чем общая активность фермента, коррелирует с клиникой болевого синдрома при анкилозируюшем спондилите.
Активность ЩФ увеличивается при некоторых заболеваниях кишечника: язвенном колите, регионарном илеите, кишечных инфекциях. Повышение ее отмечено и при заболеваниях мышц, карциноме легких, фиброаденоме молочной железы и «почечном рахите».
Лейкемия, в большей степени миелоидная, сопровождается умеренным возрастанием активности щелочной фосфатазы крови. По-видимому, при ней имеет место выход фермента из разрушающихся лейкоцитов в кровь.
Активность ЩФ в сыворотке крови повышается при беременности, достигая максимума к моменту родов; щелочную фосфатазу вырабатывают микроворсинки трофобластической мембраны. Это позволяет расценивать показатель активности ЩФ как тест оценки состояния плаценты при беременности.
Снижение активности щелочной фосфатазы в крови возникает при ослаблении остеобластических процессов, например, при замедленном росте у детей.
Активность ЩФ сыворотки крови уменьшается при гипотиреозе, авитаминозе С (цинге), старческом остеопорозе, выраженной анемии, квашиоркоре, ахондроплазии, кретинизме, состояниях, связанных с накоплением радиоактивных веществ в костях
Понижение активности отмечается при хронической миелоидной лейкемии и при некоторых гепатологических заболеваниях.
Повышение активности ЩФ в лейкоцитах (сосредоточена в нейтрофилах), выявляемое чаще всего методами цитохимии, отмечается при синдроме Дауна и, по-видимому, связано с нарушениями в 21-й хромосоме.
Содержащийся в плазме крови фермент с молекулярной массой 110 000 Д не фильтруется патологически неизмененными клубочками почек. В связи с этим в норме моча содержит лишь следы активности щелочной фосфатазы.
Повышение активности ЩФ в моче отмечается после травматического повреждения почек или их заболевания. Полагают, что это почечный фермент, подвергшийся модификации в моче. Источником высокой фосфатазной активности экскрементов, видимо, является слизистая оболочка кишечника.
Повышение активности КФ, в большом количестве содержащейся в предстательной железе, при нормальном уровне ЩФ указывает на новообразования в этой железе.
Возрастание активности КФ наблюдается через 1—2 сут после оперативного вмешательства на предстательной железе (а также при ее биопсии).
Активность КФ значительно увеличивается при повышенном разрушении тромбоцитов, тромбоэмболиях, гемолитических состояниях, поражении костей метастазами опухолей, иногда при миеломной болезни.
Возрастание активности КФ сопровождает болезни почек, поражения гепатобилиарной системы, системы фагоцитирующих мононуклеаров.
Замечено, что активность ревматического процесса коррелирует с возрастанием активности кислой фосфатазы в сыворотке крови. Наиболее высокая активность фермента наблюдается у больных с затяжным и непрерывно рецидивирующим процессами. Этот тест может быть применен для оценки эффективности гормональной терапии и выявления малоактивных форм ревматического процесса с неблагоприятным течением.
Лихорадочное состояние также может, привести к ложному повышению данного показателя.
Лабораторная работа № 2.
|
|
|
