Фазы взаимодействия фага с бактериальной клеткой, внутриклеточное развитие и репродукция фага

Лекция обсуждена на

кафедральном совещании

«____» 2009 г

д.м.н. Таран Т.В.

Ставрополь, 2009

Бактериофаги (или просто фаги) – вирусы бактерий (от лат. Bacteriophaga – пожирающий бактерии).

Бактериофагия – процесс взаимодействия фагов с бактериями, часто заканчивающийся разрушением последних.

Приоритет открытия фагов (1916) принадлежит Феликсу Д’Эррель – канадскому ученому, работавшему в Париже в Институте Пастера. Занимаясь изучением дизентерии, Феликс Д’Эррель обратил внимание на то, что возбудитель, высевающийся в начале заболевания в большом количестве, в конце болезни перестает выделяться. Заподозрив здесь действие какого-то агента, Д’Эррель решил его обнаружить. С этой целью к свежей бульонной культуре дизентерийной палочки он стал добавлять по нескольку капель фильтрата испражнений больного. В результате Д’Эррель обнаружил этот агент по способности разрушать дизентерийные бактерии и назвал его Bacteriophagum intestinale, т.е. «выделенный из кишечника пожиратель бактерий». Последующие наблюдения показали, что фаги распространены повсеместно. Они встречаются везде, где есть бактерии – в почве, воде, кишечном тракте человека и животных, гнойных выделениях и т.д.

Т.о., бактерии являются хозяевами специальной группы вирусов, названных бактериофагами, или «фагами». Хотя любой фаг строго специфичен в отношении своего хозяина, вероятно, что каждый тип бактерий может быть хозяином для одного и более фагов. Фаги имеют большое значение, т.к. являются идеальными объектами для изучения взаимоотношений хозяин-паразит и вирусной репродукции. Фаги различаются по форме, типу взаимодействия с микроб­ной клеткой и специфичности.

Простота культивирования, короткий период генерации, высокий выход потомства и возможность точного его количественного учета способствовали успешному изучению как структуры вирусных частиц, так и механизмов их взаимодействия с бактериальной клеткой. Именно фаги оказались удобной моделью для изучения тонкой структуры гена, молекулярных механизмов мутагенеза, расшифровки генетического кода, влияния ионизирующей радиации на наследственные структуры организма.

Выделение и очистка. Если к растущей в жидкой питательной среде культуре чувствительных бактерий добавить в небольшом количестве частицы вирулентного бактериофага, то некоторые бактериальные клетки окажутся зараженными. Вначале никаких видимых изменений зараженных клеток обнаружить нельзя. Обычно этот период продолжается от 15 мин до 1 ч и более. Затем внезапно происходит лизис зараженных клеток. При лизисе зараженных клеток высвобождается большое количество новых фаговых частиц потомства. Эти фаги могут в свою очередь заражать другие клетки популяции, при этом вновь и вновь повторяется тот же самый процесс. Через определенное время практически вся популяция бактерий будет уничтожена.

Число фаговых частиц или зараженных бактериальных клеток в суспензии легко определить, если подходящее разведение этой суспензии нанести на чашку с агаром, на поверхность которого равномерно нанесена разбавленная суспензия чувствительных интактных бактерий. После соответствующей инкубации вся поверхность чашки будет покрыта сплошным слоем бактерий, за исключением тех мест, где оказались частицы фага или зараженные фагом бактерии. В результате последовательных циклов развития фага пленка бактерий вокруг таких точек локально разрушается и образуются прозрачные зоны лизиса – бляшки.

Если имеется смесь зараженных клеток и свободных фаговых частиц, то их можно разделить, используя, например, дифференциальное центрифугирование. Затем с помощью описанного метода подсчета бляшек определить по отдельности число тех и других. Если нужно определить лишь число фаговых частиц, содержащихся в суспензии, то можно избирательно убить присутствующие в ней зараженные клетки. Обычно для этого суспензию клеток и фага встряхивают с хлороформом, к которому фаги устойчивы, а бактерии погибают. Можно пропустить суспензию через мембранный фильтр, который задержит на себе бактериальные клетки, а в фильтрате окажутся частицы фага.

При необходимости получения больших количеств фага заражают фагом экспоненциально растущую в жидкой среде культуру бактерий. В результате ряда циклов развития фага большинство, а иногда и все клетки культуры лизируются. Затем оставшиеся в культуре клетки и их обломки удаляют с помощью низкоскоростного центрифугирования, а получившуюся жидкость стерилизуют либо фильтрованием, либо обрабатывая ее хлороформом. В результате получается стерильный лизат, который содержит обычно от 10⁹ до 10¹² фаговых частиц, которые освобождаются из клеток при лизисе.

Для окончательной очистки бактерифагов обычно используют ультрацентрифугирование. Даже самые мелкие частицы фага осаждаются при ускорениях порядка 100 000 g (в 10⁵ раз превышающих ускорение под действием земного притяжения). Часто предварительно вирусные частицы осаждают сульфатом аммония или некоторыми другими веществами.

Резистентность к факторам окружающей среды. Фаги обладают большей устойчивостью к действию физических и химических факторов, чем многие вирусы человека. Большинство из них инактивируется при температуре не ниже 65-70 ºС. Фаги хорошо переносят замораживание и длительное хранение при низких температурах, а также высушивание. 0,5 % раствор сулемы, 1 % раствор фенола не оказывают на них заметного действия, но 1 % раствор формалина инактивирует фаг через несколько минут. Фаги обладают высокой чувствительностью к кислотам. УФ лучи и ионизирующая радиация вызывают их инактивацию, а в более низких дозах – мутации.

Морфология. Большинство фагов имеет форму головастика или спермато­зоида, некоторые фаги имеют кубическую или нитевидную фор­му. Из всех бактериофагов наиболее изучена группа фагов, которые паразитируют на клетках штамма B Escherichia coli. Это несколько фагов, обозначенные номерами от Т1 до Т7 (здесь Т означает «тип» –типовые). Как оказалось, три из этих фагов (Т2, Т4 и Т6) оказались близкородственными и обладают рядом свойств, которые делают их особенно удобными для экспериментальной работы. В частности, ДНК этих Т-четных фагов содержит вместо цитозина уникальное основание, 5-оксиметилцитозин. Определяя химическим методом его содержание, можно следить за синтезом вирусной ДНК в зараженных клетках в присутствии избытка бактериальной ДНК (содержащей обычный цитозин).

Долгие годы считали, что Т-четные фаги являются типичными представителями фагов. Однако при ЭМ-исследовании выявилось, что вирионы Т-четных фагов устроены гораздо сложнее, чем у других фагов, а механизмы их адсорбции и проникновения в клетку-хозяина в значительной степени специализированы. Тем не менее, после проникновения Т-четных фагов в клетку в ней, по-видимому, происходят такие же события, что и при заражении другими ДНК-содержащими фагами.

Размеры фагов колеблются от 20 до 200 микрон, т.е. в тех же пределах, что и размеры вирусов. Величина и форма фагов варьируют в довольно широких пределах даже у особей одного и того же вида, что говорит о морфологической изменчивости фагов.

Фаги могут существовать в двух формах:

1) внутриклеточной (это профаг, чистая ДНК);

2) внеклеточной (это вирион).

 

Структура фага. Большинство фагов имеют сперматозоидную форму. Под микроскопом отчетливо видно, что они состоят из вытянутой икосаэдрической головки и хвостового отростка, внутри которого имеется цилиндрический стержень, со­общающийся отверстием с головкой. Снаружи хвостовой отросток покрыт чехлом, который способен сокращаться наподобие мыш­цы. Заканчивается хвостовой отросток шестиугольной базальной пластинкой, имеющей короткие шипы с нитевидными структурами, называемыми фибриллами.

Головка соответствует плотно упакованному ядру, состоящему из нуклеиновой кислоты, окруженной белковой оболочкой – капсидом. Белковый капсид головки состоит из идентичных субъединиц (капсомеров), объединенных в призматическую структуру, обычно имеющую гексагональную форму в поперечном разрезе.

Бактериофаги содержат или ДНК, или РНК. Нуклеиновые кислоты фагов могут быть двунитевыми, однонитевыми, линейными, кольцевыми. Большинство фагов содержит двунитевую ДНК, замкнутую в кольцо. Количество ДНК и белка примерно одинаково. Самый мелкий из известных фагов имеет головку размером 25 нм; другие фаги имеют размеры от 55×40 до 100×70 нм. У некоторых фагов внутри головки находится внутренний гистоноподобный белок, обеспечивающий суперспирализацию ДНК.

Хвостовой отросток фаговой частицы по сложности своей структуры варьирует у разных фагов. Наиболее сложного состава хвост у фага Т2, а также у ряда других коли- и тифозных фагов. У этих фагов хвост состоит, по крайней мере, из 3 частей: полого центра шириной 6-10 нм, сократительной стенки шириной 15-25 нм и терминальной базальной пластинки гексагональной формы, к которой могут прикрепляться выступы (зубцы) и (или) хвостовые нити. От последних зависит специфическая адсорбция на клетке-хозяине.

На электронных микрофотографиях, полученных при негативном контрастировании, можно видеть фаговые частицы в двух состояниях: у одних частиц головка резко выделяется на электроноплотном фоне и чехол отростка растянут, у других головка мало отличается от фона по плотности и чехол находится в сокращенном состоянии. Первое состояние характерно для активного фага, в головке которого заключена ДНК, второе – для фага, который инъецировал свою ДНК в бактериальную клетку.

Хвост фага является органом для адсорбции (для тех фагов, у которых он есть). Однако некоторые фаги полностью утратили хвосты: у РНК-содержащих фагов, например, капсид представляет собой простой икосаэдр. Фаги могут также различаться по морфологии терминальной структуры: одни имеют базальные пластинки, другие – «выпуклости», у третьих специфические терминальные структуры утрачиваются. Многие бактериофаги имеют более простое строение.

В хвостовом отростке фага содержится лизоцим, растворяющий стенку клетки-хозяина; на конце отростка расположены фибриллы, определяющие специфичность адсорбции.

В зависимости от формы зрелых фаговых частиц различают ряд морфологических типов фагов:

Ø нитевидные ДНК-содержащие фаги, которые лизируют «мужские» клетки, несущие F-плазмиды;

Ø фаги с аналогом отростка – это мелкие РНК-содержащие фаги и фаги с одной спиралью ДНК;

Ø фаги без отростка;

Ø фаги с коротким отростком и двунитчатой ДНК (Т3, Т7 и др.), отличаются между собой строением отростка;

Ø ДНК-содержащие фаги с несокращающимся «чехлом» отростка и головкой разной формы и величины (Т1, Т5 и др.). Длинный отросток заканчивается базальной пластинкой разнообразной формы;

Ø

фаги с сокращающимся «чехлом» отростка и сложной структурой (Т2, Т4, Т6 и др.).

Нитевидные фаги весьма различаются своей морфологией. Характер упаковки их вириона еще недостаточно изучен. ДНК образует комплекс с белком и служит материалом для центральной части вирусной частицы.

Большинство фагов содержит двухцепочечную ДНК, но были обнаружены фаги с одноцепочечной ДНК и несколько с одноцепочечной РНК. РНК-содержащие фаги fr, Qb и др. обладают наименьшими из известных геномов: в них 3500-4500 нуклеотидов.

Подобно другим вирусам, фаги неподвижны.

Фазы взаимодействия фага с бактериальной клеткой, внутриклеточное развитие и репродукция фага

 

Наиболее часто процесс взаимодействия фага с клеткой протекает по типу продуктивной инфекции и обычно заканчивается лизисом клеток бактериальной культуры. Но возможна и абортивная инфекция, при которой фаговое потомство не образуется, а бактериальные клетки сохраняют свою жизнедеятельность. Наконец, нередко наблюдается лизогенизация бактериальных клеток инфицирующим фагом, в результате чего возникает состояние лизогении (вирогении), характеризующееся интеграцией генома фага в геном бактериальной клетки.

В зависимости от типа взаимодействия различают вирулент­ные и умеренные бактериофаги. Вирулентные бактериофаги взаимодействуют с бактерией по продуктивному типу. Умеренные бактериофаги заражают бактерий-хозяев, но не размножаются в них автономно и не вызывают лизиса - интегративный тип взаимодействия. При интегративном типе – геном фага встраивается в хромосому бактерии и сосуществует с ней.

Процесс взаимодействия вирулентного фага с бактериальной клеткой состоит из последовательной смены отдельных стадий. Стадии продуктивной инфекции:

I стадия – адсорбция. На клеточной стенке бактерий имеются рецепторы, на которых адсорбируются соответствующие фаги. Рецепторы различаются по химическому составу. Рецепторы для одних фагов находятся в липопротеиновом слое, для других – в липополисахаридном. Для ряда фагов рецепторы находятся на отростках клеток – жгутиках или пилях. Фагорезистентность некоторых бактерий определяется, вероятно, отсутствием у них соответствующих рецепторов в результате мутаций. При избытке бактериофага на одной клетке может адсорбироваться 200-300 фаговых частиц, хотя для заражения достаточно и одной. Фаг может адсорбироваться и на изолированных клеточных стенках, в то время как на протопластах, полностью лишенных клеточной стенки, адсорбции не происходит.

Литический цикл инфекции начинается с того, что частица бактериофага случайно сталкивается с клеткой-хозяином. Если у вириона имеется участок адсорбции, химически комплементарный специфическому рецепторному участку на поверхности бактериальной клетки, то происходит необратимая адсорбция. На процесс адсорбции фага большое влияние оказывают условия среды: солевой состав, рН, температура, а также наличие в среде строго определенных веществ – кофакторов адсорбции, например, триптофана для адсорбции фагов Т4, Т6. Некоторые фаги в качестве рецепторов используют половые пили бактерий.

II стадия – пенетрация (проникновение). Фаги, имеющие сократительный механизм в хвостовой части, такие, как Т3, подобно шприцу инъецируют свою ДНК в периплазматическое пространство между клеточной стенкой и клеточной мембраной. Затем ДНК проникает в клетку через мембрану с затратой энергии хозяина.

Некоторые мелкие кубические фаги, способные адсорбироваться на половых пилях, вводят свою нуклеиновую кислоту через канал этих пилей.

Известен механизм пенетрации и других фагов. Нитевидные ДНК- содержащие фаги проникают в клетку по другому механизму. В этом случае через клеточную стенку проникает весь вирион. Белок, преобладающий в оболочке фаговой частицы, остается на клеточной мембране (ЦПМ), а фаговая ДНК, вместе с минорным оболочечным белком (А-белком) проникает в цитоплазму.

Установление фагового генома:

Однонитевая ДНК – к репликативному аппарату для синтеза комплементарной ей нити и образования репликативной формы; далее – аналогично двунитевой

Двунитевая ДНК – к транскрипционному аппарату для синтеза мРНК и последующей трансляции вирусспецифических белков (ферментов и структурных)

РНК-геном – к трансляционному аппарату для синтеза вирусспецифических белков (ферментов репликации и структурных).

III стадия – биосинтез фаговой НК и белков капсида. В первые минуты после проникновения НК внутрь бактериальной клетки в течение латентного периода фаговые частицы обнаружить не удается. У E. coli этот период продолжается в среднем 25 мин, в искусственно разрушенных бактериальных клетках также не удается обнаружить фага.

Инъецированная ДНК фага, прежде всего, вызывает полную пере­стройку метаболизма зараженной клетки. Сразу же прекращается синтез бак­териальной ДНК, через несколько минут прекращается также синтез бакте­риальной РНК и бактериальных белков, хотя общее количество белка про­должает непрерывно возрастать. Синтез ДНК возобновляется, даже с повы­шенной скоростью.

Сначала фаговая ДНК образуется за счет распавшейся бактериальной. Эту перестройку и последующее новообразование фаговой ДНК можно проследить по увеличению количества 5-гидроксиметилцито­зина – основания, специфичного для ДНК Т-четных фагов.

Необходимые для синтеза фаговой ДНК ферменты образуются в клетке уже вскоре после заражения; это так называемые «ранние» белки. К «поздним» белкам относятся белки оболочки и фаговые лизоцимы, или эндолизины; они образуются лишь во второй половине латентного периода.

Репликация фаговой ДНК протекает в соответствии с общим механизмом репликации, однако детали этого механизма варьируют в зависимости от того, реплицируется ли фаговая ДНК в виде кольцевой (симметричный и асимметричный способы) или в виде линейной молекулы. В течение очень короткого периода (минуты) в клетке синтезируется несколько сотен новых фаговых хромосом, которые по мере образования беспорядочно обмениваются генетическим материалом.

12Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: