Развитие цитологии и гистологии в XX веке

Изобретение микроскопа и открытие клетки

История цитологии и гистологии восходит к изобретению микроскопа в конце XVI – начале XVII вв. По свидетельству Пьера Бореля (1655) этот оптический прибор был изобретен в 1590 г. оптическим мастером Иоганном Янсеном из Миддельбурга (Нидерланды). Изготовленный Иоганном Янсеном и его сыном Захариасом микроскоп стал известен в Лондоне с 1619 г. благодаря Корнелию Дреббелю.

Независимо от этого Галилео Галилей обнаружил, что при удлинении сконструированного им в 1609 г. телескопа можно увидеть детали строения мелких животных. Это наблюдение послужило основой нового прибора оккулино, который был преподнесен в 1624 г. князю Федерико Чези – основателю научного общества «Академия деи Линчеи». На следующий год Федерико Чези и Франциско Стеллути опубликовали работу, в которой описали микроскопическое строение пчелы. Эта работа под названием Apiarium интересна тем, что является первым биологическим исследованием, выполненным с помощью сложного микроскопа. Микроскоп Галилея состоял из двояковыпуклой и двояковогнутой линз, что давало прямое изображение объекта. В 1611 г. немецкий астроном Иоганн Кеплер предложил более компактную схему из двух выпуклых линз, которая давала перевернутое изображение.

Микроскопом такого типа пользовался и английский физик Роберт Гук, автор вышедшей в 1664 г. книги «Микрография», в которой под номером XVIII содержится первое описание клеток (рис. 1). Объект в нем располагали на круглом диске, освещали через наполненный водой стеклянный шар и наблюдали в падающем свете. Гук ввел в микроскоп дополнительную линзу между объективом и окуляром, при помощи которой можно было расширять поле зрения. Микроскоп Гука получил широкое распространение во второй половине XVII – начале XVIII вв.

Открытие Гуком клетки стимулировали дальнейшее изучение микроскопического строения растений и животных. Больших успехов на этом поприще добился английский врач и ботаник Неемия Грю. Начав свои исследования в 1664 г., он через шесть лет представил Лондонскому Королевскому обществу доклад по анатомии растений, опубликованный в 1672 г. Именно Грю ввел в биологию термин ткань (по аналогии с переплетающимися нитями текстильной ткани), которым через полтора века стали называть предмет отдельной науки – гистологии. В работе «Анатомия растений» (1682) он описал микроскопическое строение корня, стебля, листьев, плодов и семян, заложив тем самым фундамент новой науки.

 

 

Рис. 1. Титульный лист книги Роберта Гука «Микрография» и рисунок 1 к наблюдению XVIII, на котором изображены клетки в срезе пробки

 

Изучением строения растений с помощью микроскопа занимался в XVII в. итальянский врач Марчелло Мальпиги. В 1671 г. он представил в Королевское общество двухтомный труд «Анатомия растений», в котором на большом материале подтвердил их клеточное строение. Мальпиги известен исследованиями не только растений, но и животных. В частности, он открыл кровеносные капилляры, лимфоидные фолликулы, крипты в тонком кишечнике, ростковый слой в эпидермисе, выделительные и дыхательные канальцы у беспозвоночных и т.д.

Первые сложные микроскопы, в которых было установлено несколько линз, сильно страдали от сферической и хроматической аберрации, что вынуждало ученых использовать вместо них простые микроскопы, или лупы. Пожалуй, самым известным ученым конца XVII – начала XVIII вв., который пользовался лупами собственного изготовления, был житель голландского города Дельфт Антон ван Лёвенгук (рис. 2). Свои наблюдения и зарисовки с подробным описанием применяемых методов он посылал в период 1673-1723 гг. в Лондонское Королевское общество, членом которого был избран в 1680 г.

Наиболее крупным достижением Лёвенгука стало открытие мира простейших, которые он именовал мельчайшими животными. Он также впервые описал бактерии, дрожжи, эритроциты, сперматозоиды и многие другие микрообъекты, но истинное значение многих из них стало известно гораздо позднее.

Рис. 2. Антон ван Лёвенгук (1632-1723) и один из его микроскопов

Известно, что русский царь Петр I, будучи в Голландии в 1697 г., встречался с Лёвенгуком и приобрел у него микроскопы для Кунсткамеры в Петербурге. Работы Лёвенгука были опубликованы в семи томах в период 1695-1722 гг. под названием «Тайны природы», а затем в сокращенном варианте в конце XVIII в.

Простым микроскопом активно пользовался и другой голландский ученый XVII в. Ян Сваммердам, который первым начал систематические исследования анатомии насекомых – муравьев, пчел, ос, стрекоз, бабочек, улиток и червей.

В XVIII в. как простые, так и сложные микроскопы стали выпускать в большом количестве. Однако они использовались не для научных исследований, а, главным образом, для развлечений. Об этом свидетельствуют, в частности, такие публикации как «Ежемесячные инсектологические развлечения» Рёзеля фон Розенгофа (1746-1761) и «Микроскопические утехи для души и для глаз» Мартина Ледермюллера (1762-1763). К этому же времени относится появление художественных произведений, инспирированных микроскопом: «Путешествия Гулливера» Джонатана Свифта и «Микромегас» Вольтера.

Продолжалось и усовершенствование конструкции микроскопа. Прибор Карла Гертеля из Галле (1716) уже имел подвижный столик, микрометрический винт и зеркало. Штатив в микроскопах XVIII в. стал более устойчивым и удобным в работе. Центр их изготовления перемещается в Англию, где известность получают мастера Кёльпепер, Кёфф и Мартин. Микроскопы Адамса достигали увеличения 1000 крат, однако из-за высокого уровня аберраций они оставались не востребованными наукой и служили больше в качестве украшений.

Тем не менее, и в XVIII в. был выполнен ряд микроскопических исследований, оставивших свой след в науке. К ним, в частности, относятся работы швейцарского зоолога Авраама Трамбле, который при изучении гидры обнаружил явление регенерации (1744), немецкого анатома и физиолога Каспара Фридриха Вольфа, использовавшего микроскоп для доказательства теории эпигенеза (1759) и диссертация русского врача Александра Шумлянского «О строении почек» (1782).

Создание клеточной теории

В самом начале XIX в. французский анатом Мари Франсуа Ксавье Биша в книге «Общая анатомия в приложении к физиологии и медицине» (1801) формулирует представление о тканях, как элементарных составных частях организма по аналогии с химическими элементами. Используя эту идею, Карл Майер в работе «О гистологии и классификации тканей человеческого тела» (1819) дает наименование науке о тканях, а Карл Гейзингер в «Системе гистологии» (1822) определяет предмет и задачи этой науки.

Первая научная школа в гистологии была создана выдающимся чешским ученым Яном Эвангелиста Пуркинье. Одним из первых он стал применять фиксацию тканей уксусной кислотой и этиловым спиртом, просветление их скипидаром и оливковым маслом, окрашивание и заключение в канадский бальзам. Ученик Пуркинье Адольф Ошатц разработал устройство для получения тонких срезов ткани – микротом. В 1832 г., будучи профессором физиологии в Бреславле (современный Вроцлав), Пуркинье приобрел микроскоп и стал привлекать студентов к научным исследованиям. Пуркинье и его ученики изучали микроскопическое строение нервной системы, желудка, сердца, сосудов, хряща, костей и других органов. С 1850 г. Пуркинье работает в Праге, где специально для него учредили физиологический институт.

Систематическое изучение микроскопического строения тканей человека и животных проводилось с 1833 г. на кафедре анатомии и физиологии Берлинского университета. Ее руководителю, профессору Иоганнесу Мюллеру, удалось создать крупнейшую научную школу, из которой вышли такие выдающиеся ученые как анатомы и гистологи Теодор Шванн, Якоб Генле, Роберт Ремак и Альберт Кёлликер, физиологи Эмиль Дюбуа-Реймон, Герман Гельмгольц и Эрнст Брюкке, патолог Рудольф Вирхов, зоологи Эрнст Геккель и Фриц Мюллер.

 

 

 

Рис.3. Ян Пуркинье (1787-1869), Иоганнес Мюллер (1801-1858)

и Теодор Шванн (1810-1882)

 

В 1839 г. вышла монография Теодора Шванна “Микроскопические исследования о соответствии в структуре и росте растений и животных”. В этой небольшой по объему книге были сформулированы положения фундаментальной парадигмы биологии – клеточной теории строения живых организмов. В предисловии к ней Шванн излагает главную идею своего сочинения, которая заключается в том, что «всем отдельным элементарным частицам всех организмов свойственен один и тот же принцип развития, подобно тому, как все кристаллы, несмотря на различие их форм, образуются по один и тем же законам». За предисловием следует введение, в котором рассматривается растительная клетка, и две главы с фактическим материалом. В первой исследовано клеточное строение хорды и хряща, а во второй показано, что ткани в организме животного состоят или развиваются из клеток. Завершает книгу теоретическая глава, где дается обзор результатов, и на их основе формулируются положения клеточной теории:

· Как растения, так и животные состоят из сходных элементов – клеток, что свидетельствует о единстве всей живой природы.

· Сходство клеток растений и животных вытекает из общего для них способа образования

· Известное в ботанике представление о клетке как автономной элементарной единице растительного организма надо распространить и на животных.

· Организм представляет собой совокупность образующих его клеток и поэтому «основа питания и роста лежит не в организме как целом, а в отдельных элементарных его частях – клетках».

Создание клеточной теории и развитие гистологии стимулировали улучшение механики и оптики микроскопа. Первый ахроматический объектив был изготовлен в 1757 г. английским мастером Джоном Доллондом из сортов стекла с различными показателями преломления – кроном и флинтом. Используя этот принцип, Йозеф Фраунгофер в 1811 г. разработал ахроматический микроскоп с увеличением 120 крат и разрешением 3 мкм. К тому времени, когда возникли научные школы Пуркинье и Мюллера, лучшие ахроматические микроскопы, которые выпускали Шевалье (Париж), Плессль (Вена) и Шик (Берлин), достигли разрешения 0.5 мкм, а их увеличение превысило 2000 крат.

Окончательное оформление гистологии произошло благодаря руководствам Альберта Кёлликера «Гистология, или учение о тканях человека» (1852) и Франца Лейдига «Учебник гистологии человека и животных» (1857).

 

Возникновение цитологии

Дальнейшее развитие клеточной теории связано с открытием протоплазмы и доказательством клеточной природы простейших. Термин «протоплазма» был впервые использован Пуркине в отношении вещества клеток животных (1840), а позднее, в 1846 г., Гуго Моль обнаружил движение протоплазмы клеток растений. К середине XIX в. благодаря исследованиям А. Кёлликера, Ф. Дюжардэна, К. Зибольда и М. Шульце было окончательно установлено, что тело простейших состоит из одной клетки.

Несмотря на то, что клеточное ядро животной клетки было описано Пуркинье в 1825 г., а растительной – шотландским ботаником Робертом Броуном в 1831 г., его центральная роль в процессе образования клеток была признана только после появления клеточной теории. Шванн считал, что клетки образуются путем конденсации материала ядра из бесструктурного вещества (теория цитобластемы). Однако еще в 1835 г. в статье «О размножении клеток путем деления» Г. Моль описал клеточное деление у водоросли. Последующие работы Франца Унгера (1841) и Карла Негели (1844) показали, что клетки растений образуются только путем деления. Аналогичный вывод в отношении клеток животных был обоснован Робертом Ремаком (1852). Окончательно деление было признано единственным способом размножения клеток после выхода в свет книги Рудольфа Вирхова «Клеточная патология, основанная на физиологическом и патологическом учении о тканях» (1858). В этой книге он провозгласил свой знаменитый афоризм omnis cellula e cellula – любая клетка от клетки.

В 1861 г. венский физиолог Эрнст Брюкке опубликовал статью «Элементарные организмы», которая сыграла важную роль в развитии клеточной теории. Первоначально клетка рассматривалась как универсальный структурный элемент ткани, который устроен достаточно просто. Брюкке выступил с новой идеей: если рассматривать клетку как автономную систему, обладающую всеми свойствами живого, она должна иметь сложную организацию. Особое внимание Брюкке уделял раздражимости и движению протоплазмы, полагая, что в ней должны быть структуры, аналогичные органам – органоиды.

Перенесение на клетку организменной парадигмы принципиально изменило подходы к ее изучению. В наиболее отчетливой форме это было выражено в книге бельгийского ученого Жана Батиста Карнуа «Биология клетки» (1884), который предложил рассматривать клетку как самостоятельный предмет изучения новой науки – цитологии. Карнуа формулирует три основных задачи цитологии:

· исследование общей структурно-функциональной организации клетки;

· изучение специализации клеток в зависимости от выполняемых ими функций (т.е. особенностей клеток различных тканей)

· сравнительный анализ клеток (т.е. особенностей клеток одной ткани у различных организмов).

Первой работой, посвященной превращениям клеточного ядра во время деления клетки, была монография Эдуарда Страсбургера «О клетообразовании и клеточном делении» (1875), в которой он на растительных и животных клетках показал, что при их делении ядро претерпевает сложную перестройку, приводящую к появлению двух дочерних ядер. Эта работа привлекла внимание ученых, и в последующие годы появился ряд детальных исследований этого процесса.

Наибольшего успеха в изучении деления клетки добился немецкий ученый Вальтер Флемминг. В 1882 г. выходит его книга «Клеточная субстанция, ядро и клеточное деление», в которой рассматривается строение цитоплазмы и ядра, вводятся понятия о прямом (амитоз) и непрямом (кариокинез) делении клеток, детально описывается процесс деления ядра – митоз. В 1885 г. Карл Рабль в работе «О клеточном делении» показал, что описанный Флеммингом в профазе митоза непрерывный клубок образован отдельными нитями, число которых специфично для каждого вида организмов. В статье Генриха Вальдейера «О кариокинезе и его отношении к явлениям оплодотворения» (1888) эти нити получили название хромосом.

Деление ядра яйцеклетки в процессе ее созревания, которое было позднее названо мейозом, первыми исследовали Эдуард ван Бенеден, Теодор Бовери и Оскар Гертвиг. Решающее значение имела работа Гертвига «Материалы к познанию образования, оплодотворения и деления животного яйца» (1875), где было показано слияние женского и мужского пронуклеусов в единое ядро зиготы. В 1884 г. Гертвиг и Страсбургер независимо друг от друга предложили гипотезу, что клеточное ядро является носителем наследственности.

В 1890 г. Рихард Альтман выдвинул предположение, что в каждой клетке в виде нитей и зерен обитают особые микроорганизмы - биобласты, способные к самостоятельному размножению. Более поздние работы Карла Бенда и Фридриха Мевеса показали, что биобласты Альтмана являются универсальными клеточными органоидами – митохондриями. В 1897 г. Камилло Гольджи обнаружил в клетках нервной ткани еще один универсальный органоид – пластинчатый комплекс. Благодаря исследованиям Мартина Гейденгайна и других ученых в эти же годы был изучен клеточный центр.

 

 

Рис. 4. Эрнст Брюкке (1819-1902), Эдуард Страсбургер (1844-1912))

и Вальтер Флемминг (1843-1905)

 

Расширение цитологических исследований потребовало максимального увеличения и разрешения микроскопа, но одновременно приходило понимание, что геометрической оптики для конструирования новых микроскопов уже недостаточно. Это признавали, в частности, Негели и Швенденер в книге «Микроскоп: теория и применение» (1865).

Гельмгольц в статье «Теоретическая граница способности микроскопа» (1874) показал, что разрешающую способность микроскопа ограничивают падение яркости изображения и дифракция света. Детальное исследование процесса формирования изображения в микроскопе было выполнено немецким физиком Эрнстом Аббе. Он показал, какую роль в микроскопе играют объектив и окуляр, дал классификацию возникающих аберраций и обосновал существование предела его разрешающей способности. Первая публикация Аббе по теории микроскопа относится к 1873 г., но полностью она была изложена в книге С. Чапского «Теория оптических инструментов по Аббе» (1893). По расчетам Аббе фирма Цейсс выпустила в 1886 г. объективы-апохроматы, в которых были максимально исправлены хроматическая и сферическая аберрации, и разрешающая способность достигла 0.25 мкм.

К этому времени возросло и качество цитологических препаратов. Если раньше ученые исследовали живые неокрашенные клетки, то теперь они стали использовать фиксирующие смеси сложного состава для сохранения структуры ядра и протоплазмы. Например, Флемминг разработал фиксатор в виде смеси хромовой, осмиевой и уксусной кислот, который долгое время считался лучшим в цитологии. Совершенствовались также методы окрашивания препаратов, где наряду с природными пигментами кармином и гематоксилином стали использовать синтетические анилиновые красители индигокармин, эозин, кислый и основной фуксины, метиленовый синий и другие. Одним из лучших в цитологии стал предложенный Гейденгайном метод окраски железным гематоксилином, позволяющий выявлять тончайшие детали строения клеток.

О становлении цитологии как самостоятельной науки свидетельствовало появление фундаментальных обзоров Оскара Гертвига “Клетка и ткани” (1892) и Эдмунда Вильсона “Клетка в развитии и наследственности” (1896).

Развитие цитологии и гистологии в XX веке

Начало XX в. ознаменовалось появлением цитогенетики – науки, посвященной изучению хромосом. Благодаря работам Т. Бовери (1902) и У. Сэттона (1903), стало очевидным, что их поведение в мейозе соответствует тому, которое было предсказано ранее Г.Менделем. Принципы классификации хромосом были разработаны русским цитологом С.Г. Навашиным, который в 1898 г. открыл двойное оплодотворение у растений.

В 1903 г. австрийские ученые Р. Зигмонди и Р. Зидентопф разработали ультрамикроскоп (теперь этот метод называется темным полем), который позволял подсчитывать взвешенные частицы минимальным размером 20-30 нм. В таком микроскопе частицы освещались через узкую горизонтальную щель сильным источником света, а объектив устанавливался перпендикулярно оптической оси, что позволяло наблюдать их в виде светящихся точек на темном фоне. Поскольку эти изображения не могли быть меньше дифракционного предела в 250 нм, они не давали никакого представления об истинных размерах и форме частиц.

В 1904 г. Августом Кёлером и Морицем фон Рёром был сконструирован первый ультрафиолетовый микроскоп, который имел приблизительно в два раза большую разрешающую способность по сравнению с обычным микроскопом. Хотя ультрафиолетовая микроскопия не получила большого распространения, она явилась основой для создания таких широко распространенных в современной клеточной биологии методов как флуоресцентная микроскопия и цитометрия.

Кардинального увеличения разрешающей способности микроскопа удалось добиться создателям электронной микроскопии. Появление нового типа микроскопии было обусловлено открытием волновых свойств электрона (Л. де Бройль, 1924) и разработке методов расчета их отклонения в магнитном поле (Г. Буш, 1926). Первый просвечивающий электронный микроскоп был построен Эрнстом Руской и Максом Кнолем в 1931 г., а первый сканирующий электронный микроскоп –Манфредом фон Арденне в 1937 г.

Уже первые модели электронного микроскопа имели разрешающую способность в несколько нм, что дало возможность исследовать тонкую структуру клетки и ее органоидов. В дальнейшем электронная микроскопия достигла разрешения на биологических объектах около 0,1 нм, позволяя получать изображения субклеточных структур вплоть до молекулярного уровня. За изобретение электронного микроскопа Эрнст Руска был удостоен Нобелевской премии по физике за 1986 г.

Не менее важным для дальнейшего развития клеточной биологии было изобретение шведским химиком Теодором Сведбергом ультрацентрифуги (Нобелевская премия по химии 1926 г.). Разделение надмолекулярных компонентов клетки с помощью ультрацентрифуги и их исследование в электронном микроскопе позволили в период 40 – 80 гг. XX в. исследовать структурно-функциональную организацию клеточного ядра, биологических мембран, митохондрий и хлоропластов, центриолей, ресничек и жгутиков, миофибрилл, аппарата Гольджи и других органоидов. С помощью электронной микроскопии были открыты такие клеточные органоиды как рибосомы, лизосомы, клатриновые везикулы, нуклеосомы и т.д. Электронный микроскоп позволил также увидеть вирусы, молекулы ДНК и работающие гены, что наполнило клеточную биологию принципиально новым содержанием. Особенно эффективным оказалось сочетание световой микроскопии, которая обеспечивает первоначальную ориентацию в микропрепарате, с детальным описанием обнаруженных изменений с помощью электронной микроскопии. В качестве примера можно привести открытие физиологической гибели клеток – апоптоза и доказательство принципиального отличия его от некроза методами световой и электронной микроскопии (Дж. Керр, А. Керри и Э. Уайли, 1972).

К концу XX в. в клеточной биологии проявилась тенденция комплексных исследований клетки и происходящих в ней процессов с привлечением методов световой и электронной микроскопии, биохимии, молекулярной генетики и компьютерного моделирования. При этом возрастает роль многочисленных вариантов флуоресцентной микроскопии, которые позволяют работать с живыми клетками, используя специфические молекулярные зонды.

В 1961 г. японский химик О. Шимомура выделил из медузы Aequorea victoria белок, который флуоресцирует зеленым светом – G reen F luorescent P rotein, или GFP. Когда через 33 года нейробиологу из Колумбийского университета в США М. Чалфи удалось ввести ген этого белка в клетки, появилась возможность пометить им любые другие гены или молекулярные векторы. В настоящее время ген gfp и его мутанты с различными спектрами флуоресценции широко используются для визуализации экспрессии генов.

В последнее время значение электронной микроскопии в клеточной биологии несколько снизилось, поскольку она позволяет исследовать только фиксированный материал ограниченным набором методик. Альтернативой электронной микроскопии может стать световая микроскопия высокого разрешения, разработка методов которой идет быстрыми темпами.

Как уже отмечалось, согласно теории Аббе разрешающая способность светового микроскопа ограничена дифракцией до точки диаметром 250 нм. Однако еще в 1896 г. в работе «О теории оптических изображений в приложении к микроскопу» английский физик лорд Рэлей отметил, что при определенных условиях интерференции волн разрешение микроскопа может быть значительно больше дифракционного предела. Позднее, уже во второй половине XX в. было установлено, что структурированное освещение (через дифракционную решетку или с помощью лазера) позволяет увеличить разрешение, но для сложных объектов, как в цитологическом препарате, требуется дополнительная обработка изображений. К концу XX в. в связи с развитием оптики, электроники и компьютерной техники появилась возможность полностью реализовать метод структурированного освещения и повысить разрешение светового микроскопа приблизительно в два раза.

В 1994 г. немецкий физик Стефан Хель опубликовал статью с изложением принципа нового метода микроскопии, который основан на стимулированном истощении флуоресценции – STED. В этом методе один лазер возбуждает флуоресценцию молекул внутри дифракционной точки диаметром 250 нм, тогда как синхронизированный с ним другой лазер принудительно вызывает флуоресценцию кольца с наружным диаметром 250 нм внутри этой же точки. В результате флуоресценция молекул разделяется по времени на две вспышки, причем более поздняя из них исходит от молекул из внутренней зоны кольца, диаметр которой меньше дифракционного предела. В настоящее время разрешение метода STED в три раза превышает разрешение обычного светового микроскопа.

Третий метод световой микроскопии высокого разрешения восходит к принципу ультрамикроскопии, разработанной более 100 лет назад. Как уже отмечалось, она позволяла подсчитывать взвешенные частицы, размеры которых не превышали 20-30 нм, что на порядок меньше дифракционного предела микроскопа. В 1997 г. американский ученый Уильям Мернер открыл управляемое мерцание молекул зеленого флуоресцирующего белка GFP, что давало возможность определять их координаты путем анализа формы дифракционной точки. Похожий метод был разработан другим американским физиком Эриком Бетцигом, который показал, что определение координат молекул ниже дифракционного предела возможно для любых флуоресцирующих молекул, если возбуждать только небольшую часть из них (<0.1%).

Достигнутое к настоящему времени разрешение этих методов представлено в таблице 1. Параметры конфокальной лазерной сканирующей микроскопии даны для сравнения как наилучшие у классической схемы светового микроскопа.

За разработку методов микроскопии высокого разрешения Штефану Хелю, Уильяму Мернеру и Эрику Бетцигу была присуждена Нобелевская премия по химии за 2014 г.

 

 

Таблица 1

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: