 |
для регуляции синтеза белков
|
|
|
|
Эукариоты широко используют возможность регулировать синтез белка на посттранскрипционном уровне. Возникшая при транскрипции пре-мРНК у эукариот претерпевает процессинг (подробно о нем – см. [ Ошибка! Источник ссылки не найден. ]). Регулировать образование зрелых мРНК можно через изменение активности ферментов и вспомогательных белков, нужных для кэпирования, образования полиА-хвоста, обычного и альтернативного сплайсинга.
Альтернативный сплайсинг позволяет получить различные белковые продукты с одного гена благодаря “сшиванию” разных наборов экзонов и интронов при построении разных мРНК. Большое значение имеют присущие эукариотическим клеткам механизмы управления альтернативным сплайсингом. Характер сплайсинга регулируется белками, способными связываться с пре-мРНК в районе интронов или на границе “экзон-интрон”. Присоединение таких регуляторных белков может блокировать удаление одних интронов, одновременно активируя вырезание других. Например, с гена кальцитонина может синтезироваться как сам гормон кальцитонин, так и пептид другого строения. В С-клетках щитовидной железы активен один набор регуляторов сплайсинга, поэтому в результате сплайсинга объединяются экзоны 1–4 пре-мРНК, которые кодируют кальцитонин. В чувствительных нейронах работает другой набор регуляторов сплайсинга, поэтому образуется альтернативная мРНК, в которой отсутствует экзон 4, но прибавляются экзоны 5 и 6. В результате вместо кальцитонина синтезируется иной по строению пептид.
На конечный результат – синтез белка – влияет также скорость транспорта РНК из ядра в цитоплазму, время “полужизни” мРНК, степень ее стабильности в цитоплазме, скорость поступления на рибосомы и эффективность связывания с ними.
|
|
|
Временем полужизни” называют время, в течение которого популяция молекул данного типа мРНК уменьшается наполовину. Известно, что время существования мРНК увеличивается с удлинением ее полиА-хвоста. Время полужизни большинства мРНК дрожжей составляет 10-20 мин, хотя для некоторых оно уменьшается до 1 мин, а для других возрастает до 35 мин. У млекопитающих время полужизни мРНК обычно составляет несколько часов.
Клетка имеет возможность резко снизить время полужизни нежелательных мРНК (например, вирусных): с помощью особых малых РНК и специальных белковых комплексов такие мРНК обнаруживаются и расщепляются. Этот механизм носит название РНК-интерференции, или посттранскрипционного генного сайленсинга (см. главу 5).
Скорость освобождения РНК от сопровождающих белков и поступления на рибосомы регулируется белками, окружающими ее в информосомах (РНП-комплексах). В цитоплазме мРНК могут определенное время храниться в виде нетранслируемых мРНП-комплексов.
Некоторые из белков этих комплексов участвуют в регуляции матричной активности мРНК. Например, если в РНП-комплексе на одну молекулу мРНК приходится 5 – 10 молекул белка p50, трансляция этой РНК ингибируется, если 1 – 4 молекулы – активируется. Предполагают, что при более высоком содержании белка его С-концевые части освобождаются от контактов с РНК и начинают взаимодействовать между собой. Это приводит к мультимеризации белка и переходу мРНП в конденсированное (нетранслируемое) состояние.
(c) Блокирование “закольцовывания” мРНК. Присоединение miRISC не дает мРНК приобрести правильную конформацию, необходимую для трансляции. Роль микроРНК в трансляционной репрессии
Определенные микроРНК могут блокировать трансляцию не по механизму РНК-интерференции – без деградации мРНК-мишени. Цепи miРНК этой группы только по краям комплементарны мРНК-мишени, а в середине нуклеотиды не совпадают. Это приводит к “выпячиванию” середины после присоединения к мРНК-мишени, что и вызывает трансляционную репрессию. В настоящее время предложены несколько вероятных механизмов трансляционной репрессии, некоторые из которых иллюстрирует рис. 29.
|
|
|
Созревание РНК
Если у прокариотических организмов только что транскрибированная мРНК
функционально активна и начинает транслироваться сразу, еще до того, как синтезирован
ее 3’-конец, то у эукариот после транскрипции пре-мРНК подвергается созреванию.
Только правильно созревшая мРНК транспортируется из ядра и транслируется только в
цитоплазме. Транспортная и рибосомная РНК подвергаются созреванию как у про-, так и
у эукариот.
Что такое созревание? Созревание - это во-первых, разрезание РНК на более
мелкие фрагменты, включая сплайсинг – вырезание фрагмента из середины молекулы
РНК. Иногда два фрагмента РНК могут обмениваться участками, участвуя в т.н. транс-
сплайсинге. К мРНК эукариотических организмов присоединяется полиадениловая
кислота в ходе полиаденилирования. К созреванию относят также ковалентные
модификации РНК. Этот тип созревания характерен для функциональных РНК, таких, как
рибосомная. Наиболее экзотический тип созревания это редактирование, когда в
определенные места мРНК добавляются дополнительные нуклеотиды.
Созревание мРНК
Созревание мРНК происходит в ядре эукариотических клеток. Он начинается, как
правило, уже в ходе транскрипции. Подавляющее большинство клеточных мРНК
кепируется, т.е. к 5’-концу мРНК добавляется m7Gppp. Трифосфатная группа соединяет
5’-конец мРНК и 5’-OH метилированного гуанозина. На 3’-конец мРНК довешивается
полиадениловая кислота.
Большинство генов эукариот имеет прерывистое строение, т.е. участки,
кодирующие мРНК (экзоны), перемежаются с интронами - участками, вырезаемыми из
пре-мРНК при сплайсинге. Белковые комплексы, отвечающие за кепирование, сплайсинг
и полиаденилирование взаимодействуют между собой, а также с РНК пролимеразой II.
Фосфорилированная форма CTD РНК полимеразы II, т.е. форма, характерная для
элонгирующей РНК полимеразы, служит площадкой для присоединения аппарата
|
|
|
созревания.
Кепирование
Как только РНК полимераза синтезировала около 25 нуклеотидов мРНК ее 5’-
конец подвергается кепированию (рис. 37). Ферменты, осуществляющие кепирование
предварительно связываются с CTD РНК полимеразы.
Сначала от 5’-трифосфатной группы отщепляется γ-фосфат фосфатазой Cet1p,
затем нуклеотидил трансфераза Ceg1p переносит остаток GMP от GTP на β-фосфат. После
переноса гуанилатного остатка происходит метилирование концевого гуанозина по N7
атому белком Abd1p. После кепирования мРНК к ее 5’-концу присоединяется ядерный
кеп-связывающий комплекс, состоящий из белков CBP20 и CBP80. Кепирование
необходимо для защиты мРНК от деградации, а также играет важную роль при
трансляции мРНК в цитоплазме. Ядерный кеп-связывающий комплекс стимулирует
дальнейшие этапы созревания.
Сплайсинг
Сплайсинг – это процесс вырезания внутренних участков пре-мРНК, назыв
интронами. Бывает несколько разновидностей сплайсинга. Наиболее распространенный
тип – это вырезание интронов с помощью малых ядерных РНП (мяРНП). Эти небольшие
РНК, связанные с белками имеют ряд особенностей. Их 5’-конец закрыт кепом, причем в
отличии от мРНК остаток гуанозина на 5’-конце не моно-, а триметилирован (по N7 и
дважды по N2). Кроме того, мяРНК как правило содержат Sm последовательность, к
которой присоединяется набор из семи Sm белков. Эти маркеры мяРНК нужны для
направленного транспорта их в ядро и прикрепления к фосфорилированному CTD РНК
полимеразы II.
сплайсосоме (т.е. комплексу, осуществляющему
сплайсинг
Полиаденилирование
После того, как все интроны вырезаны и РНК полимераза II синтезировала участок
мРНК, содержащий сигналы полиаденилирования, происходит разрезание мРНК. Затем,
на образовавшийся свободный 3’-конец мРНК последовательно навешиваются остатки
адениловой кислоты. Как аппарат созревания понимает, где проводить разрезание мРНК и
полиаденилирование?
У высших эукариот есть две последовательности: AAUAAA и GU-богатая,
|
|
|
определяющие место разрезания и последующего полиаденилирования (рис. 47). Кроме
того, наличие 5’-концевого кепа, а точнее присутствие ядерного кеп-связывающего
комплекса также способствует полиаденилированию. Все эти элементы узнаются
соответствующими белковыми факторами. Так, AAUAAA последовательность узнается
CPSF, GU-богатая – CstF. Связывание этих факторов кооперативно за счет
взаимодействия белков 160kD CPSF с 77kD CstF. С CPSF связана polyA-полимераза
(PAP).
Разрезание мРНК происходит между AAUAAA и GU-богатой
последовательностями с помощью 2 факторов: CFI и CFII. После разрезания мРНК PAP
начинает медленное наращивание полиаденилата.
Когда добавленный “хвост” позволит связывание первой молекулы ядерного
polyA-связывающего белка полиаденилирование вступает в быструю процессивную фазу.
После того, как длина полиаденилового довеска достигнет порядка 200 нуклеотидов, PAP
заканчивает работу. Как polyA полимераза определяет, сколько остатков она уже добавила
непонятно, хотя ясно, что тут также играет роль ядерный polyA-связывающий белок.
В результате ядерного созревания мРНК оказывается кепированной и
полиаденилированной. При этом с кепом связан ядерный кеп-связывающий комплекс, а с
polyA-“хвостом” – ядерный polyA-связывающий белок. Оба эти элемента, вместе с
белками, оставленными сплайсосмой, необходимы для успешного экспорта
сплайсированной, целостной мРНК из ядра.
Первичная структура тРНК
тРНК - относительно небольшие молекулы, длина их цепей варьирует от 74 до 95 нуклеотидных остатков. Все тРНК имеют одинаковый 3'-конец, построенный из двух остатков цитозина и одного - аденозина (CCA-конец). Именно 3'-концевой аденозин связывается с аминокислотным остатком при образовании аминоацил-тРНК. CCA-конец присоединяется ко многим тРНК с помощью специального фермента. В других случаях он считывается с кодирующего данную тРНК гена. Нуклеотидный триплет, комплементарный кодону для аминокислоты (антикодон), находится приблизительно в середине цепи тРНК. В отдельных положениях последовательности практически у всех видов тРНК встречаются одни и те же (консервативные) нуклеотидные остатки. В некоторых положениях могут находиться или только пуриновые, или только пиримидиновые основания (их называют полуконсервативными остатками).
Для всех молекул тРНК характерно присутствие большого числа (до 25% всех остатков) разнообразных модифицированных нуклеозидов, часто называемых минорными. Они образуются в различных местах молекул, во многих случаях четко определенных, в результате модификации обычных нуклеозидных остатков с помощью специальных ферментов. Общий список выявленных в тРНК модифицированных нуклеозидов превышает 60 названий. Среди них много метилированных производных, часто встречаются псевдоуридин (5-рибофуранозилурацил, Y), 5,6-дигидроуридин, D, 4-тиоуридин, инозин и многие другие.
|
|
|
Вторичная структура тРНК
Анализ нуклеотидной последовательности уже первой расшифрованной дрожжевой аланиновой тРНК выявил возможность складывания цепи во вторичную структуру за счет взаимокомплементарности участков цепи. Из рис. 1 видно, что три фрагмента цепи оказываются комплементарными при складывании их на себя, образуя шпилькообразные структуры. Кроме того, 5'-конец комплементарен участку, близкому к 3'-концу цепи, при их антипараллельном расположении; они формируют так называемый акцепторный стебель. В результате образуется структура, характеризующаяся наличием четырех стеблей и трех петель, которая получила название "клеверного листа". Стебель с петлей формируют ветвь. На рис. 1 внизу расположена антикодоновая ветвь, содержащая антикодоновый триплет в составе своей петли. Слева и справа от нее расположены D- и T-ветви, соответственно названные так из-за присутствия в их петлях необычных консервативных нуклеозидов дигидроуридина (D) и тимидина (T). Нуклеотидные последовательности всех изученных тРНК могут быть сложены в аналогичные структуры. В дополнение к трем петлям клеверного листа в структуре тРНК выделяют также дополнительную, или вариабельную, петлю (V-петлю). Ее размеры резко различаются у разных тРНК, варьируя, как это обозначено на рис. 1, от 4 до 21 нуклеотида, а по последним данным, и до 24 нуклеотидов.
Двутяжевые стебли, имеющие постоянное число спаренных нуклеотидов, представляют собой двойную спираль. На виток этой спирали приходится 11 пар нуклеотидных остатков, она близка по параметрам к A-форме ДНК (см. статью В.И. Иванова "А-ДНК", опубликованную в "Соросовском Образовательном Журнале". 1998. № 1. С. 2-7). Неспаренные участки молекулы тРНК (петли и CCA-конец) также имеют вторичную структуру: несколько расположенных друг за другом нуклеотидных остатков образуют однотяжевую спираль за счет межплоскостных взаимодействий их оснований (так называемый стэкинг оснований).
Пространственная (третичная) структура тРНК
Изображение тРНК в виде клеверного листа на плоскости имеет такое же отношение к реальной пространственной структуре молекулы, как развертка куба, изображенная на листе бумаги, к трехмерному кубу. Впервые трехмерная структура тРНК была установлена в 1974 году для дрожжевой фенилаланиновой тРНК с помощью рентгеноструктурного анализа ее кристаллов. С тех пор удалось закристаллизовать и расшифровать пространственную структуру еще почти десятка тРНК из дрожжей и кишечной палочки.
Общие принципы складывания цепей различных тРНК в компактную третичную структуру оказались универсальными. За счет взаимодействия элементов вторичной структуры формируется третичная структура, которая получила название L-формы из-за сходства с латинской буквой L (рис. 2 и 3). За счет стэкинга оснований акцепторный стебель и T-стебель клеверного листа образуют одну непрерывную двойную спираль (одну из "палочек" - доменов буквы L), а два других стебля - антикодоновый и D - другую непрерывную двойную спираль (второй домен L). При этом D- и T-петли оказываются сближенными и скрепляются между собой путем образования дополнительных, часто необычных пар оснований. В образовании этих пар, как правило, принимают участие консервативные или полуконсервативные остатки. В свете этого становится ясным, зачем они присутствуют в D- и T-петлях. Аналогичные третичные взаимодействия скрепляют и некоторые другие участки L-структуры. CCA-конец тРНК и ее антикодоновый триплет находятся на максимальном удалении один от другого (расстояние около 8 нм), причем основания антикодона обращены внутрь угла L-образной молекулы. Любители загадочных картинок могут проследить ход нуклеотидной цепи тРНК в трехмерной структуре на рис. 3, основываясь на схематическом изображении рис. 2, б.
Индивидуальные различия в первичной структуре отдельных видов тРНК проявляют себя на уровне как вторичной, так и третичной структур. Известные структуры тРНК, специфичных для разных аминокислот, различаются величиной угла между доменами L-структуры и некоторыми другими деталями.
Аминоацилирование тРНК
Как уже указывалось, для каждой из 20 аминокислот в клетках есть специальный фермент, осуществляющий синтез соответствующей аминоацил-тРНК (общее название - аминоацил-тРНК-синтетазы, для краткости будем называть их синтетазами). Все ферменты этой группы катализируют реакции аминоацилирования тРНК по принципиально сходному механизму. Реакция сопряжена с расщеплением аденозин-5'-трифосфата (ATP) и протекает в две стадии. На первой стадии происходит активация аминокислоты с использованием энергии, запасенной в ATP, а на второй активированный аминоацильный остаток переносится на одну из гидроксильных групп рибозного кольца концевого аденозина на CCA-конце тРНК (остаток 76 на рис. 1).
Например, валил-тРНК-синтетаза катализирует суммарную реакцию синтеза валил-тРНК:
Val + тРНК + ATP Val-тРНК + AMP + PP,
включающую следующие две стадии:
E + Val + ATP E*(Val-AMP) + PP,
E*(Val-AMP) + тРНК E + AMP + Val-тРНК,
где E - фермент, Val - валин, ATP и AMP - аденозин-5'-три- и монофосфат соответственно, PP - пирофосфат, E*(Val-AMP) - комплекс фермента с аминоациладенилатом, тРНК - специфическая валиновая тРНК, Val-тРНК - валил-тРНК.
Как видно из уравнения (2), образующийся на первой стадии реакции аминоациладенилат Val-AMP, в котором остаток валина активирован за счет гидролиза макроэргической связи ATP и отщепления пирофосфата, не покидает молекулы валил-тРНК-синтетазы, образуя с ней комплекс. Происходящий затем перенос аминоацильного остатка из Val-AMP на валиновую тРНК (уравнение (3)) завершает реакцию аминоацилирования тРНК и приводит к освобождению фермента и AMP.
Исключительно низкая частота ошибок при аминоацилировании тРНК (<10- 4) является непременным условием реализации генетического кода. Дело в том, что при биосинтезе белков в рибосомах выбор аминокислоты, включающейся в растущую белковую цепь, зависит исключительно от адапторной молекулы тРНК, к которой она прикреплена. Если на предрибосомном этапе произошла ошибка и к тРНК присоединилась аминокислота, не соответствующая специфичности антикодона, то эта ошибка уже не может быть исправлена на последующих этапах белкового синтеза. При этом не имеет значения, при отборе какого из субстратов реакции (1) - тРНК или аминокислоты - ошиблась соответствующая аминоацил-тРНК-синтетаза. В любом случае продукт реакции (аминоацил-тРНК) будет включать в синтезирующуюся в рибосоме молекулу белка аминокислотный остаток, не соответствующий кодирующему триплету мРНК.
Неудивительно, что в ходе эволюции выработались специфические механизмы отбора "правильных" субстратов для аминоацил-тРНК-синтетаз, обеспечивающие безошибочное аминоацилирование тРНК. В связи с особым значением этих механизмов для реализации генетической информации их называют иногда вторым генетическим кодом. Молекулярным механизмам, обеспечивающим высокую точность отбора синтетазами правильных аминокислот, посвящена статья О.И. Лаврик "Механизмы специфического отбора аминокислот в биосинтезе белка" (Соросовский Образовательный Журнал. 1996. № 4. С. 18-23). Отбор "правильных" тРНК в этих реакциях зависит от узнавания ферментом отдельных элементов L-образной структуры молекул тРНК, о чем речь пойдет ниже.
Молекулярные основы узнавания тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами
Каждая тРНК, сохраняя универсальную L-образную форму, должна иметь какие-то отличительные признаки, безошибочно распознаваемые "своим" ферментом как "притягательные", а остальными 19 ферментами - как "отталкивающие". Очевидно, что такие признаки должны быть общими у изоакцепторных тРНК, специфичных для одной и той же аминокислоты.
Вопрос о молекулярной основе высокоточного узнавания тРНК "своей" и только "своей" синтетазой интересовал ученых со времени открытия этих макромолекул. Довольно скоро стало ясно, что за несколькими исключениями модифицированные нуклеотиды не являются теми элементами, которые распознает синтетаза. Значительный прогресс в понимании принципов этого РНК-белкового взаимодействия был достигнут в последнее десятилетие с появлением возможности направленно изменять строение белков и нуклеиновых кислот, разработкой методов компьютерного моделирования их пространственных структур, а также кристаллизации и рентгеноструктурного анализа комплексов тРНК со "своей" синтетазой. На сегодняшний день ученые знают, хотя бы в первом приближении, набор нуклеотидов, существенных для аминоацилирования "своих" тРНК почти каждой аминоацил-тРНК-синтетазой из кишечной палочки. Такой набор, естественно разный для разных пар тРНК - синтетаза, включает нуклеотиды, занимающие одни и те же положения в структуре большинства тРНК. Это следующие участки тРНК (см. рис. 1).
1. Антикодон (остатки 34-36). Участие антикодона, определяющего на рибосоме включение аминокислоты в растущую цепь белка, еще и в отборе этой аминокислоты на стадии реакции аминоацилирования тРНК, предполагалось еще в 60-е годы исходя из уникальности этого элемента в структуре молекулы. Данные последних лет показывают, что в узнавании может участвовать один или более нуклеотидов антикодона.
2. Нуклеотид 73, предшествующий CCA-концу. Присутствие в этом положении того или другого пуринового нуклеотида (A или G) коррелирует с типом аминокислот, присоединяемых к тРНК. Если в этом положении находится A, то тРНК акцептирует гидрофобные аминокислоты, а если G - то полярные.
3. Первые три пары нуклеотидов акцепторного стебля (1-72, 2-71, 3-70). В разных случаях в узнавании синтетазой может вовлекаться от одной до трех пар нуклеотидов акцепторного стебля.
Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в основном те же участки тРНК узнаются аминоацил-тРНК-синтетазами из других организмов. В случае некоторых тРНК к элементам узнавания относят также отдельные неконсервативные нуклеотиды D- и T-петель (в первую очередь в положении 20 D-петли). У каждой отдельной тРНК синтетазами может узнаваться только часть перечисленных элементов. Другими словами, число нуклеотидов, определяющих индивидуальность каждой тРНК (то есть ее свойство быть опознанной всеми 20 аминоацил-тРНК-синтетазами таким образом, что "своя" синтетаза присоединяет к ней аминокислоту, а остальные 19 синтетаз ее "отвергают"), невелико. Для каждой отдельной пары тРНК - синтетаза узнавание определяется ограниченным числом элементов структуры тРНК, перечисленных выше. По мнению некоторых авторов, иногда для узнавания бывает достаточно одного какого-либо элемента структуры, например одной нуклеотидной пары в акцепторном стебле.
Отчетливая картина того, как синтетаза узнает на молекулярном уровне "свою" тРНК, была получена с помощью рентгеноструктурного анализа для тех нескольких комплексов синтетаза " тРНК, которые удалось закристаллизовать. Впервые структура кристалла была установлена в 1989 году для комплекса глутаминовой тРНК с глутаминил-тРНК-синтетазой из кишечной палочки. На рис. 4 видно, как два домена тРНК по внутренней стороне угла L-структуры вступают в контакт с ферментом, причем отдельные функциональные группы элементов узнавания - антикодона и CCA-конца тРНК - обволакиваются белковой молекулой.
Существенно важным для достижения подобного структурного соответствия между ферментом и субстратом является взаимная подгонка двух макромолекул, которая происходит в результате их конформационных изменений. Так, было установлено, что структура глутаминовой тРНК в свободном состоянии и в комплексе со "своей" синтетазой существенно изменяется, а другие тРНК, если они и связываются с глутаминил-тРНК-синтетазой, неспособны так точно "подогнаться" к поверхности фермента. Динамический процесс конформационных изменений макромолекул является важной составной частью их взаимного узнавания и последующей реакции аминоацилирования тРНК.
Рекогниция – процесс узнавания тРНК своей АК, происходящий при помощи фермента аминоацил-тРНК-синтетазы.
Рибозим (сокращение от «рибо нуклеиновая кислота» и «эн зим»), также называемая ферментативной РНК или каталитической РНК — это молекула РНК, обладающая каталитическим действием. Многие рибозимы естественного происхождения катализируют расщепление самих себя или других молекул РНК, кроме того образование пептидной связи в белках происходит при помощи рРНК рибосомы. В рамках исследований, посвященных происхождению жизни, удалось создать искусственные рибозимы типа РНК-полимеразы, способные при определенных условиях катализировать свою собственную сборку [1]. Лабораторные образцы, однако, показали невысокую каталитическую способность: они успевают собрать в цепочку не более 14 нуклеотидов за 24 часа, по истечении которых они разлагаются за счет гидролиза фосфодиэфирных связей.
|
|
|
