 |
Ингибиторный иммуноферментный анализ
|
|
|
|
ИФА
В основе самых распространенных на сегодня методов иммуноанализов лежит взаимодействие АГ+АТ, которое визуализуется с помощью специальной метки, заранее конъюгированной либо с АТ, либо с АГ. В качестве меток используют вещества, которые могут «увидеть» и измерить приборы.
Физико-химическая чувствительность таких анализов очень высока и обычно составляет нанограммы на миллиметр.
Метод был предложен в начале 70-х годов тремя независимыми группами исследователей: Engvall и Perlmann в Швеции, van Weemen и Schuur в Нидерландах и Rubenstein с сотр. в США.
АГ или АТ, вступающее в иммунную реакцию, метится ферментом. По превращению субстрата ферментом можно судить о количестве вступившего во взаимодействие компонента реакции антиген-антитело.
Чувствительность иммуноферментного анализа позволяет определять минимальные количества вещества (нанограммы).
Известно много вариантов постановки иммуноферментного анализа. Различают гомогенный и гетерогенный вариант иммуноферментного анализа.
В основе гомогенного ИФА лежит ингибирование активности фермента при соединении его с гаптеном (активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело).
Либо, наоборот, потеря активности маркерного фермента в результате реакции антиген-антитело. Поэтому удаление свободного АГ из смеси, содержащей антиген в связанном виде, в составе иммунных комплексов невозможно.
При гетерогенном ИФА антигены или антитела фиксируется па твердой фазе (как правило, пластик), а непрореагировавшие компоненты реакции удаляются многократным отмыванием.
Различают методы конкурентного и неконкурентного анализа.
Конкурентный метод. Используют для количественного определения АГ, который м.б. получен в чистом виде. Используют конъюгат «АГ-фермент» и фиксированные на твердой фазе АТ.
|
|
|
Варианты меток и материалов для твердой фазы
Метки
1. Радионуклид, используемый при радиоиммунном анализе (РИА).
2. Ферменты, катализирующие превращение бесцветного субстрата в цветной или флюоресцирующий продукт. (ИФА, иммуноферментно-флюоресцентный анализ).
3. Флюоресцирующие, люминесцирующие вещества и др.
В случае ИФА результат реакции определяют с помощью спектрофотометра, измеряющего оптическую плотность.
По чувствительности и специфичности РИА и ИФА одинаковы, т.к. их показатели определяются аффинностью взаимодействия АТ и АГ, а не типом метки.
Однако ИФА применяют намного чаще, чем РИА, т.к. реагенты для ИФА существенно дольше остаются стабильными, и, следовательно, технологию ИФА проще стандартизировать.
Сначала иммуноанализы разрабатывали в т.н. гомогенных вариантах (без разделения компонентов в растворе). Но вскоре в технологии иммуноанализов начали использовать твердую фазу, на которой методом спонтанной сорбции из раствора фиксируется АГ или АТ. Анализы стали называть твердофазными, или иммуносорбентными (англ. ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay).
Технологически твердофазные анализы удобнее гомогенных тестов. В настоящее время твердофазные варианты ИФА применяют в 99,9% тест-систем.
В качестве «твердой фазы» используют следующие материалы:
1) пластмассу (полистирол, поливинилхлорид и др.) в виде стандартно штампованных микроплашек с 96 или 60 лунками (или шарики, колпачки и др. для постановки единичных проб);
2) пористые материалы (нитроцеллюлоза) в виде наполнителей:
- в объеме
- плоских листов
- или полосок стрипов (англ. strip);
Стрипы используют в методиках иммуноблота и иммунохроматографии.
Принцип иммуносорбентных анализов заключается в том, что на материале твердой фазы в соответствии с физико-химическими свойствами сорбируется АГ или АТ.
|
|
|
Существует много вариантов конструкций тест-систем для иммуноанализов. Мы разберем несколько базисных и более подробно объясним значения терминов.
Прямые иммуноанализы
Прямыми называют анализы, в которых метку непосредственно присоединяют либо к заданному АГ, либо к АТ, специфичному против искомого АГ.
Прямой вариант используют в следующих анализах:
- конкурентном, ингибиторном, сэндвич-ИФА
- и иммуноферменто-метрическом анализе (слайд 21).
Ингибиторный иммуноферментный анализ
В ингибиторном ИФА на твердой фазе иммобилизуют АГ. Растворимые АТ как реагент конъюгированы с ферментом. Определяемый АГ в испытуемой пробе конкурирует с иммобилизованным на твердой фазе АГ-ом за растворимые АТ.
В итоге ферментативная активность обратно пропорциональна концентрации определяемого вещества в пробе. Результаты ИФА показаны на слайде 22.
«Сэндвич»-ИФА
«Сэндвич»-ИФА (слайд 23) разработан для АГ-ов, на которых есть не менее 2х неперекрывающихся эпитопов (это та часть АГ, которая взаимодействует со специфичными АТ.
АТ к одному из эпитопов сорбируют на твердой фазе. Испытуемую пробу добавляют к твердой фазе, инкубируют, отмывают.
После отмывки вносят конъюгат АТ ко 2му эпитопу с ферментом. Ферментативная активность, остающаяся на твердой фазе, прямо пропорциональна содержанию антигена в пробе.
Преимущества «сэндвич»-ИФА:
- не требует препаратов очищенных АГ, что выгодно отличает его от других конкурентных и ингибиторных методик;
- чувствительность «сэндвич»-ИФА потенциально выше, чем конкурентных и ингибиторных.
Аналогичная технология применима:
- и с использованием одного АТ
- и на твердой фазе,
- и в составе конъюгата с ферментом в случаях наличия на заданном АГ повторяющихся эпитопов.
В современных модификациях ту же технологию называют ловушечным ИФА - АТ на твердой фазе «ловят» свой АГ из смеси веществ в биопробе.
Иммунометрический анализ
При иммунометрическом анализе в пробирку с испытуемой пробой, содержащей определяемый АГ, вносят заведомый избыток меченых АТ.
Затем к этой смеси добавляют избыток иммобилизованного на мелкодисперсной твердой фазе АГ. После инкубации центрифугированием отделяют растворимую фракцию (супернатант) и в ней измеряют ферментативную активность (если метка - фермент).
|
|
|
Ферментативная активность супернатанта прямо пропорциональна содержанию АГ в испытуемой биопробе.
Этот метод более чувствителен, чем конкурентный ИФА.
На слайде 24 представлен принцип иммунометрических анализов:
1 - пробирка с биопробой (сывороткой крови или др.);
2 - в пробирку с биопробой вносят заведомый избыток чистого АГ, сорбированного на мелкодисперсном твердофазном носителе;
3 - затем в ту же пробирку вносят заведомый избыток меченых АТ;
4 - материал инкубируют (чтобы реагенты успели связаться), центрифугируют и в супернатанте измеряют количество метки.
Величина сигнала в супернатанте прямо пропорциональна содержанию АГ в испытуемой пробе.
OD - optical density - величина оптической плотности, измеренная спектрофотометром;
АГ - концентрация искомого антигена в биопробах.
Непрямые иммуноанализы
Непрямые методики (слайд 25) применяют чаще, чем прямые.
Непрямым иммуноанализом называют анализ, в котором метку присоединяют к т.н. вторым АТ - антивидовым антииммуноглобулиновым АТ, т.е. антителам к Ig-ам того вида животных или человека, с биологическим материалом которого работают.
Таким образом, один и тот же препарат конъюгата антиглобулиновых АТ с ферментом используют для определения различных конкретных АГ или АТ в разных тест-системах.
Вместо антивидовых антиглобулиновых антител может быть использован протеин А стафилококка, который с высокой аффинностью связывается с IgG некоторых видов млекопитающих, включая человека.
Все описанные схемы постановки прямого варианта ИФА (конкурентный, ингибиторный, «сэндвич», иммунометрический) применяют и в непрямом варианте.
Преимущества непрямых вариантов ИФА:
- не требуют очистки искомых АГ или АТ;
- чистым должен быть только препарат антивидовых антииммуноглобулиновых АТ.
В качестве ферментов-меток в ИФА используются следующие ферменты и субстраты:
|
|
|
1. Пероксидаза из корней хрена, субстраты:
· орто-фенилендиамин;
· 3,3'-диаминобензидин;
· 3-амино-9-этилкарбазол;
· 5-аминосалициловая кислота;
· 2,2'-азино-бис-6-сульфоновая кислота;
· 4-хлоро-1-нафтол;
· 3,3'-диметокси-бензидин;
· 3,3',5,5'-тетраметилбензидин;
· ABTS - 2,2'-азино-ди-6-сульфоновая кислота.
2. β-галактозидаза.
3. Щелочная фосфатаза.
4. Уреаза.
Нерастворимые продукты ферментативных реакций используют в методах иммуногистохимии и иммуноблота, растворимые - в иммуноферментных анализах, в которых результат регистрируют количественно спектрофотометрически.
Встречаются оригинальные разработки с использованием других ферментов-меток.
Если по каким-либо биохимическим причинам заданный АГ или интересующее АТ не удается конъюгировать с меткой, то в конструкцию тест-системы пробуют вводить дополнительные компоненты. Например, нередко используют т.н. «авидинбиотиновое» взаимодействие.
Авидин - белок, выделяемый из «белка» куриных яиц, связывает биотин - витамин Н (или кофермент R). Биотин легко конъюгируется с флюоресцеином.
Кроме того, и против авидина, и против биотина получены высокоаффинные МонАТ.
В конкретных вариантах тест-систем используют разные буферные растворы, соответствующие свойствам конкретных АГ, ферментов и их субстратов.
Для примера мы опишем специальную лабораторную работу твердофазного непрямого ИФА.
|
|
|
