 |
Полиаденилирование у эукариот
|
|
|
|
Посттранскрипционные процессы (процессинг)
Посттранскрипционные процессы: введение
Первичный РНК-транскрипт, или про-мРНК, подвергается в клеточном ядре целому ряду превращений (Perry R.P., 1981; Chambon P., 1981; Crick F., 1979; Darnell J.E.,Jr., 1982). Происходит образование " колпачка ", метилирование внутренних оснований, кэпирование его 5'-конца, созревание 3'-конца, заключающееся в расщеплении по сайту полиаденилирования, и затем само полиаденилирование. Наконец, происходит сплайсинг и удаление интронов. Эти процессы - кэпирование, созревание 3'-конца, полиаденилирование и сплайсинг - в совокупности обозначаются как процессинг про-мРНК, или созревание мРНК. У эукариот этапу кэпирования предшествует образование "колпачка" и метилирование внутренних оснований.
Поскольку 5'-кэп и 3'- poly(A) характерны только для транскриптов, синтезируемых РНК-полимеразой II, было высказано предположение, что кэпирование или присоединение poly(A) (или оба этих процесса) протекают с участием ферментов, которые взаимодействуют с РНК-полимеразой II, но не взаимодействуют с РНК-полимеразами I и III. Необходимость маркировать подобным образом концы молекул-предшественников мРНК может служить объяснением, почему эти молекулы синтезируются специальной РНК-полимеразой.
ДНК-гистоновый комплекс
В процессе транскрипции ДНК остается в составе нуклеосом (Miller O.L., 1981) Четыре нуклеосомных гистона (H2A, H2B, H3 и H4) образуют с ДНК столь прочный комплекс, что гистоновые октамеры если и покидают связанные с ними участки ДНК, то крайне редко. Нуклеосомная структура хроматина сохраняется даже во время транскрипции и репликации ДНК.
Тот факт, что матрицей для синтеза РНК у человека служит ДНК-гистоновый комплекс, влечет за собой немаловажные последствия с точки зрения регуляции активности генов. Даже в случае растянутой нуклеосомной нити довольно трудно представить себе, что РНК-полимераза может транскрибировать ассоциированную с гистонами ДНК без каких-либо заметных изменений в структурной организации нуклеосом. И уже вовсе непостижимо, как может ДНК, находящаяся в еще более конденсированной форме (например, в составе хроматиновой фибриллы), транскрибироваться РНК-полимеразой без разрушения всей нуклеосомной структуры.
|
|
|
Рибонуклеопротеиновые частицы
Новообразованная РНК упаковывается в рибонуклеопротеиновые частицы (Beyer ea, 1977; Beyer ea, 1980), сходные с нуклеосомными ДНК-белковыми комплексами; они также образуются вдоль цепи полинуклеотида, обеспечивая необходимую компактизацию РНК-транскриптов. Среди многих видов таких рибонуклеопротеиновых комплексов доминирует один, который можно охарактеризовать как короткий участок РНК, покрытый несколькими белками с мол.массой от 30000 до 40000. Белки, образующие эти РНП-частицы, составляют один из наиболее богато представленных в клеточном ядре классов белков. Подобно тому как укладка ДНК в хроматине призвана обеспечить ее нормальное функционирование в клетке, пока еще малоизученная конденсация РНК с ядерными белками вполне может оказаться необходимой для правильного процессинга первичных РНК-транскриптов и последующего их транспорта в цитоплазму.
Гетерогенная ядерная РНК (гяРНК, hnRNA)
Вся совокупность ядерных транскриптов РНК-полимеразы II известна как гетерогенная ядерная РНК (гяРНК), поскольку одна из основных характеристик, отличающих эту фракцию ядерных РНК - это чрезвычайно высокая вариабельность размеров входящих в нее транскриптов.
По мере синтеза эти транскрипты ковалентно модифицируются по 5'-концам и 3'-концам таким образом, что они становятся отличными от транскриптов, синтезированных другими РНК-полимеразами. Эти модификации будут позже использованы в цитоплазме как сигналы того, что данные информационные РНК должны быть транслированы в белки.
|
|
|
Посттранскрипционные процессы: введение
Первичный РНК-транскрипт, или про-мРНК, подвергается в клеточном ядре целому ряду превращений (Perry R.P., 1981; Chambon P., 1981; Crick F., 1979; Darnell J.E.,Jr., 1982). Происходит образование " колпачка ", метилирование внутренних оснований, кэпирование его 5'-конца, созревание 3'-конца, заключающееся в расщеплении по сайту полиаденилирования, и затем само полиаденилирование. Наконец, происходит сплайсинг и удаление интронов. Эти процессы - кэпирование, созревание 3'-конца, полиаденилирование и сплайсинг - в совокупности обозначаются как процессинг про-мРНК, или созревание мРНК. У эукариот этапу кэпирования предшествует образование "колпачка" и метилирование внутренних оснований.
Поскольку 5'-кэп и 3'- poly(A) характерны только для транскриптов, синтезируемых РНК-полимеразой II, было высказано предположение, что кэпирование или присоединение poly(A) (или оба этих процесса) протекают с участием ферментов, которые взаимодействуют с РНК-полимеразой II, но не взаимодействуют с РНК-полимеразами I и III. Необходимость маркировать подобным образом концы молекул-предшественников мРНК может служить объяснением, почему эти молекулы синтезируются специальной РНК-полимеразой.
Кэпирование
5'-конец молекулы РНК (который синтезируется первым в процессе транскрипции) прежде всего кэпируется, т.е. достраивается с образованием особой структуры, ответственной за последующее связывание молекулы мРНК с рибосомой.
Эта структура состоит из остатка 7-метилгуаназина, ковалентно связанного с 5'-концевым трифосфатом. Кэпирование происходит еще до того, как синтез всей молекулы будет завершен.
Тем временем строящаяся молекула РНК продолжает расти в длину в направлении от 5'к 3'концу со скоростью 30 нуклеотидов в секунду, пока РНК-полимераза не достигнет сигнала терминации, закодированного в последовательности нуклеотидов ДНК.
|
|
|
Здесь транскрипция останавливается и происходит полиаденилирование. До настоящего времени роль кэпирования - присоединения 5'-конца гуанинового нуклеотида к концевому основанию мРНК, остается неясной. Одной из функций кэпа является стабилизация пре-мРНК в ядре (Green M.R., 1983). В экстракте ядер млекопитающих кэп не требуется для сплайсинга, хотя кэпированая пре-мРНК сплайсируется более эффективно. Этот эффект частично обьясняется увеличенной стабильностью кэпированой пре-мРНК в экстракте (Krainer A.R., 1984). Аналогично, кэп не является необходимой состовляющей у дрожжей (Lin R.J., 1985). В противоположность этому в клеточных экстрактах кэпирование влияет на сплайсинг, и сплайсинг может ингибироваться путем добавления аналогов кэпа. Показано, что в некоторых экстрактах кэпированая "естественным образом" РНК сплайсируется значительно более эффективно, чем другие формы РНК.
Полиаденилирование у эукариот
Полиаденилирование происходит либо непосредственно после терминации транскрипции, либо после специфического расщепления растущей цепи РНК.
Специальный фермент - poly(A)-полимераза присоединяет к 3'-концу каждого РНК-транскрипта, которому суждено стать молекулой мРНК, от 100 до 200 остатков адениловой кислоты (poly(A)), что завершает процесс образования первичного РНК-транскрипта.
Конкретные функции poly(A) неизвестны, но считается, что такой "хвост" способствует последующему процессингу РНК и экспорту зрелых молекул мРНК из ядра.
Одним из обязательных этапов созревания предшественников эукариотических мРНК, синтезированных в ядре, является процессинг их 3'-концевых последовательностей, тесно сопряженный с присоединением кэп-группы.
Созревание 3'-конца мРНК является двухэтапным процессом. Вначале предшественник теряет 3'-концевую некодирующую последовательность, после чего, как правило, к 3'-концу присоединяется поли(А)-последовательность путем ферментативной полимеризации остатков AMP (схема стр. 88).
Известно несколько исключений из этого правила: гистоновые мРНК животных и мРНК некоторых вирусов, предшественники которых расщепляются с помощью высокоспецифических эндонуклеаз и не полиаденилируются. Остаются неполиаденилированными и U-мяРНК, которые также являются транскриптами РНК-полимеразы II. В этом случае кэпированный первичный транскрипт мяРНК U1, содержащий на своем 3'-конце несколько избыточных нуклеотидов, экспортируется из ядра в цитоплазму, где и происходит удаление избыточной последовательности, которое в ядре блокировано специфическим белковым ингибитором TPI (3'-terminal processing inhibitor).
|
|
|
Места отщепления 3'-концевых некодирующих последовательностей в мРНК животных маркированы специальными последовательностями нуклеотидов (рис. I.13). Имеются, по крайней мере, две такие последовательности, образующие сайты полиаденилирования, или поли(А)-сайты.
В расщеплении РНК непосредственно участвуют еще два фактора: CFI и CFII (cleavage factors), вместе они образуют прочный комплекс с РНК. Для полного реконструирования бесклеточной системы, осуществляющей процессинг 3'-концов in vitro, в ней кроме этих факторов необходимо наличие поли(А)-полимеразы - фермента, осуществляющего полиаденилирование. Присутствие этого фермента требуется не для самого акта расщепления РНК, а, по- видимому, для стабилизации процессирующего белкового комплекса, схематически изображенного на рис. I.13 (http://humbio.ru/humbio/genexp/001aac7d.htm). Сборка комплекса зависит от ATP, однако в процессе сборки не происходит расщепления ее бета-гамма-связей. Неизвестно, какой именно компонент комплекса расщепляет фосфодиэфирные связи РНК.
Процесс полиаденилирования начинается сразу за расщеплением РНК и происходит настолько быстро, что неполиаденилированных промежуточных продуктов не обнаруживается. Такое сопряжение двух реакций необходимо для защиты 3'-концевых последовательностей РНК от деградации нуклеазами. При этом сам акт полиаденилирования требует наличия только фактора CPSF, но не трех других: CSTF, CFI и CFII.
Процессивное (непрерывное) полиаденилирование 3'-концов РНК происходит со скоростью около 25 нуклеотидов/с до тех пор, пока длина поли(А)-последовательности не достигнет примерно 250 нуклеотидов. После этого процессивная реакция прекращается, и происходит медленное дистрибутивное присоединение остатков AMP разными молекулами поли(А)-полимеразы. Предполагают, что элонгирующий белковый комплекс узнает длину синтезированной поли(А)-последовательности при участии фактора PAB II (рис. I.14 - http://humbio.ru/humbio/genexp/001aae95.htm). По этому механизму связывание определенного числа молекул PAB II с поли(А) прекращает элонгацию поли(А)-последовательности. Такой строгий контроль за длиной поли(А) на 3'-концах процессированных мРНК имеет большое значение для действия механизма, контролирующего время полужизни мРНК в цитоплазме. Без тщательного контроля над этим процессом с помощью селективного деаденилирования невозможно регулировать внутриклеточную деградацию мРНК, а вместе с тем и уровень экспрессии соответствующих генов с участием данного механизма.
|
|
|
Функции поли-А хвоста:
1) способствуют экспорту зрелых мРНК из ядра;
2) вероятно, влияют на стабильность по крайней мере некоторых мРНК в цитоплазме;
3) возможно, служат в качестве сигнала узнавания для рибосомы.
Только транскрипты, синтезированные РНК-полимеразой II, обладают 5'- кэпами и 3'-поли-А хвостами. Причиной этого, по-видимому, является то, что ферменты, опосредующие кэпирование и расщепление с последующим полиаденилированием, специфически связаны с РНК-полимеразой II. Так, если ген, в норме транскрибируемый РНК-полимеразой II, отделяется от своего промотора и присоединяется к промотору, узнаваемому РНК-полимеразой I или РНК-полимеразой III, то синтезируемые этими ферментами транскрипты не являются ни кэпированными, ни полиаденилированными. Необходимость в специфическом кэпировании и полиаденилировании предшественников мРНК может объяснить, почему эти РНК синтезируются отдельным типом РНК-полимераз у эукариот.
Сплайсинг: введение
Характерной особенностью эукариотических клеток является то, что первичный продукт транскрипции их структуных генов (пре-мРНК) подвергается ряду последуюших модификаций для получения функциональной матричной РНК. Из этих модификаций наиболее сложной и интересной является точное вырезание различных по длине внутренних участков (интронов) и сшивание оставшихся, несущих смысловую нагрузку для кодируемого белка - экзонов. Совокупность реакций, происходяших при этом называется сплайсингом. Этот процесс был обнаружен 1977 г.и получил название сплайсинга (от англ. splice - соединять концами). Удаление последовательностей интронов с помощью сплайсинга происходит в ядрах эукариот сразу после завершения синтеза пре- РНК. В сплайсинге участвуют рибонуклеопротеиновые (РНП)-частицы - малые ядерные РНП (мяРНП), в состав которых входят мяРНК U1-U6 и многочисленные белки. РНП-частицы на стыках интронов и экзонов образуют функциональный комплекс, получивший название сплайсомы. Интроны предшественников тРНК у эукариот удаляются с участием более простого набора ферментов, а для вырезания некоторых интронов не требуется никаких дополнительных компонентов, кроме самих предшественников РНК. Последний процесс получил название аутосплайсинга (self-splicing).
Разделяют две стадии этого процесса - разрыв 5' сайта сплайсинга с формированием лариата и разрыв 3' сайта сплайсинга со сшивкой экзонов, причем первая стадия всегда предшествует второй. Оба этапа сплайсинга имеют трансэстерификационный механизм. Реакция разрезания приводят к образованию 5' фосфата и 3' гидроксильной группы, требуют участия брэнч сайта и активного гуанозина.
Различают три типа пре-мРНК: группа I, группа II и ядерные пре-мРНК. Сплайсинг ядерных РНК, в отличие от аутосплайсинга происходит в сплайсосомах и требует участия специфических trans - факторов сплайсинга, производящих соответствующие конформационные и структурные изменения в РНК.
Эксперименты с мутантными РНК и регистрация значительного числа альтернативно-сплайсируемых РНК указыват на исключительное значение сплайсинга при процессинге для регуляции экспрессии генома.
На схеме стр. 92 изображен интрон, соединяющий два соседних экзона в предшественнике мРНК дрожжей. Такая же структура характерна и для пре-мРНК высших организмов. Места соединения интронов и экзонов, в которых происходит разрыв фосфодиэфирных связей пре-мРНК во время сплайсинга, в зависимости от их положения в интроне называют 5'- или 3'-концевыми сайтами сплайсинга. Полипиримидиновая последовательность (Py)n перед 3'- концевым сайтом сплайсинга существенна для правильного вырезания интронов. Остаток аденозина в консервативной последовательности нуклеотидов интрона, расположенный ближе к его 3'-концу, получил название точки разветвления (branch point). Именно с этим аденозином ковалентно соединяется 5'-конец интрона, освобождающийся на первом этапе сплайсинга с образованием структуры типа "лассо" (lariat). Первичная структура указанных сайтов мало консервативна в генах, кодирующих ядерные пре-мРНК, и может значительно варьировать даже у интронов одного и того же организма. В зависимости от механизма вырезания интронов и особенностей их пространственной структуры различают интроны групп I, II и III, интроны ядерных РНК, а также твинтроны - интроны, расположенные внутри интронов.
|
|
|
