Оценка жизнеспособности сперматозоидов

Оценка жизнеспособности сперматозоидов проводится следующим образом: после разжижения сперма перемешивается пипеткой, далее на предметное стекло помещается капля неразведенного эякулята. На препарат наносится 1% водный раствор эозина.

Лучшим методом окраски считается окраска по Блуму. На предметное стекло рядом с каплей спермы помещают вдвое большую каплю 5% раствора эозина и каплю 10% водного раствора нигрозина, вдвое большую, чем капля эозина. Сначала эякулят смешивают с каплей эозина, выжидают несколько секунд. Далее препарат смешивают с каплей нигрозина и снова выжидают. После чего делается мазок, аналогичный мазку крови. После высушивания приступают к микроскопии.

Препарат накрывается обычным покровным стеклом и через 2 минуты микроскопируется при увеличении 400х (объектив 40х, окуляр 10х). Конденсор микроскопа вначале опускается. Поскольку живые сперматозоиды не окрашиваются, а мертвые окрашиваются в розовый цвет, то достаточно просто их отличить друг от друга. Подчитывается общее число сперматозоидов в поле зрения (желательно не менее 500). Далее конденсор поднимается и ведется подсчет мертвых сперматозоидов. Процентное содержание мертвых сперматозоидов определяется по формуле:

 

Cмертв. = C розовые/C общие * 100%.

 

В норме число живых сперматозоидов должно быть более 75%, однако неоднократно наблюдается наступление беременности и при меньших значениях. Повышение числа мертвых сперматозоидов свыше 25% носит название – некрозооспермия. Причины появления мертвых сперматозоидов различны и до конца не выяснены. Возможно, что это связано с патологией придатка яичка.

Иногда используется индекс нормальных подвижных сперматозоидов (ИНПС) определяется по формуле:

 

ИНПС = V * C * A * B/10⁶,

 

где V – это объем эякулята,

C – концентрация сперматозоидов,

A – процент сперматозоидов с прогрессивной подвижностью (a +b) и

B – процент морфологически нормальных сперматозоидов.

Если значения индекс нормальных подвижных сперматозоидов больше или равен 6*10⁴, то это говорит о нормальной фертильности.

Оценка морфологии сперматозоидов

Оценка морфологии сперматозоидов (сперматограмма) проводится на неокрашенных препаратах, после обездвиживания в счетной камере. Морфологическая структура сперматозоидов является важным критерием диагностического звена, поскольку наряду с подвижностью этот параметр определяет фертильность спермы. Исследование желательно проводить при помощи фазово-контрастного микроскопа. Анализируется тот же препарат, что и для оценки подвижности клеток.

Проводится подсчет общего числа сперматозоидов в 5 больших квадратах камеры. При этом вначале можно определить число сперматозоидов с ненарушенной подвижностью и нормальным морфологическим строением. Затем изучается процент этих сперматозоидов от общего числа. Также для исследования приготавливается окрашенный препарат (мазок). Для этого используют предметные стекла, которые обезжириваются путем обработки 70⁰ спиртом. На высушенное стекло наносится капля эякулята после полного разжижения. Капля разносится по поверхности стекла с помощью другого, краем, под углом в 45⁰. Необходимо этот процесс осуществлять деликатно, что бы не допустить раздавливания препарата. Распределение материала на стекле происходит за счет капиллярных сил.

Микроскопия вначале проводится при малом увеличении. В норме в поле зрения микроскопа должно быть не менее 30 сперматозоидов, равномерно распределенных по стеклу. Окраска препарата выполняется гематоксилин-эозином. Также используется метод окраски по Папаниколау, Шору и Май-Грюнвальду-Гимзе. Исследование наиболее информативно при окраске по Папаниколау.

Мазки микроскопируют при большом увеличении 900х (иммерсионный объектив 90х, окуляр 10х). Процент морфологически нормальных сперматозоидов определяется по формуле:

 

N/C * 100%,

 

где C это число всех подсчитанных сперматозоидов,

N – число сперматозоидов с нормальной морфологией.

Общее число аномальных сперматозоидов вычисляется следующим образом:

C – N.

Эта цифра принимается за 100% для подсчета в процентном соотношении сперматозоидов с различной формой аномалии.

Например, для подсчета сперматозоидов с аномалией головки в процентах используется формула:

 

G/C – N * 100%,

 

где G – это число сперматозоидов с атипией головки,

C – это число всех подсчитанных сперматозоидов,

N – число сперматозоидов с нормальной морфологией.

Точно таким же образом идет подсчет числа сперматозоидов с патологией шейки и жгутика.

Затем определяется индекс тератозооспермии (количество дефектов, разделенное на общее число аномальных сперматозоидов).

 

Варианты морфологии сперматозоидов

 

Морфологически нормальными сперматозоидами считают такие сперматозоиды, которые имеют овальную головку, хорошо различимую акросому и жгутик. Головка может быть заострена.

В мире общепринятым определением нормального сперматозоида является правило Kruger, которое гласит: «нормальный сперматозоид – это такой, который обнаруживается в верхнем отделе цервикального канала женщины через 8 часов после полового акта». Данное утверждение основано на том, что при этой локализации сперматозоида в половых путях женщины уже произошел естественный отбор нормальных форм сперматозоидов из всего пула.

Во время проведения исследования выделяют так называемые патологические формы сперматозоидов, которые могут быть представлены следующими вариантами:

1. С атипичным строением головки.

В свою очередь различают аномалии размеров головки – макроцефалия (большая головка) и микроцефалия (маленькая головка). Могут быть варианты аномалий формы головки (каплевидная, круглая, веретенообразная, грушевидная, аморфная, резко-заостренная). Здесь же могут встречаться сперматозоиды с неправильным строением акросомы (слишком маленькая акросома, занимающая менее 40% площади головки; несимметричная акросома; вакуолизированная акросома). Головка сперматозоида может быть резко вакуолизирована, что также считается аномалией. Нередки сперматозоиды с двумя (и более) головками, а также сперматозоиды, имеющие множество ядер.

2. С атипичной шейкой.

Среди них различают сперматозоиды с утолщенной шейкой. Также аномальными считаются сперматозоиды, у которых угол между головкой и жгутиком менее 180⁰.

3. Имеющие цитоплазматические капли в области шейки или головки (более половины головки).

4. С атипичным строением жгутика.

Среди них выделяют короткий жгутик. Также могут быть сперматозоиды с изломанной формой жгутика, неравномерной толщины, закрученными жгутиками.

5. Имеющие более одного дефекта (сочетают в себе несколько аномалий одновременно).

По критериям ВОЗ число морфологически нормальных сперматозоидов не должно быть менее 30%. Повышение числа патологических форм носит название тератозооспермия. Абсолютно точные причины тератозооспермии неясны. Возможно, что это связано с наличием вирусных инфекций, ферментопатий, хромосомных нарушений.

12	Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: