Основные разновидности молекулярных маркеров

Определение маркер. Разнообразие маркеров

Генетическое разнообразие можно оценить на двух уровнях – фенотипа (сочетания индивидуальных признаков, определяющихся генотипом и его взаимодействиями) и генотипа (совокупность всех генетических элементов организма). Для оценки используют маркеры – измеряемые характеристики, которые могут обнаружить изменчивость в генотипе или фенотипе. Маркеры генетического разнообразия бывают:

1) Морфологические. Разнообразие внутри и между популяций традиционно оценивают по варьированию морфологических признаков. Они обычно легко доступны и не требуют сложного оборудования. Однако, на морфологические признаки сильно влияют факторы окружающей среды, и из-за этого они могут неадекватно отражать истинное генетическое разнообразие популяции.

2) Протеиновые (биохимические). Для оценки разнообразия популяции раньше часто использовали изоферменты - альтернативные формы фермента, осуществляющие одинаковые ферментативные реакции, но отличающиеся по аминокислотному составу и кодируемые разными генами. Изучение спектра изоферментов в популяции позволяет приблизительно оценить разнообразие в ней генов, кодирующих изучаемые ферменты. Однако, такой метод весьма ограничен генами, кодирующими ферменты, и неточен, так как на физические свойства белков очень сильно влияют условия окружающей среды, в том числе местоположение образца в дереве и стадия развития растения. Разницу в строении белков обычно определялась с помощью метода электрофореза: белки, имеющие разное аминокислотное строение, имеют разные заряд и массу, поэтому по-разному перемещаются под действием электрического тока в акриламидном или агарозном геле.

3) Маркеры ДНК (молекулярные). Отражают изменчивость последовательности ДНК. Считаются наиболее объективным показателем величины генетического разнообразия, так как потенциально не ограничены в количестве и не подвержены воздействию окружающей среды. Существует огромное количество генетических локусов, полиморфизм которых может использоваться в качестве молекулярных маркеров. Некоторые из них, наиболее консервативные, можно использовать для глобальных классификаций (Woese et. al., 1990). А некоторые, наиболее изменчивые, – для оценки разнообразия внутри популяции (Абрамсон, 2009).

Молекулярными маркерами называют такие биохимические особенности обмена веществ и, непосредственно, структурные особенности генома организма животного, растения, бактерии или гриба, которые тесно коррелируют с какими либо физиологическими показателями организма (например, активностью ферментов), связанными с хозяйственно полезными признаками этого существа. Используя молекулярно-генетические маркеры селекционер может, с огромной точностью, выбирать из популяции только животных обладающих определённым аллелем, необходимого ему, гена, такого как, например ген устойчивости к лейкозу у коров, и создавать стада устойчивые к заболеваниям, с животными генетическим здоровыми и высоко продуктивными (дата обращения: 18.02.2017 http://geolike.ru/page/gl_992.htm).

Основные разновидности молекулярных маркеров

1) RAPD (Randomly amplified polymorphic DNA) – один из самых ранних методов маркирования. Заключается в проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами в виде коротких олигонуклеотидов со случайной последовательностью, которые садятся на рандомные участки генома. В результате для каждого исследуемого образца синтезируется набор фрагментов ДНК разной длины, которые могут отличаться у разных образцов. Можно подобрать праймеры для отличия разных видов или даже сортов. Этот метод быстр и дешев, однако весьма субъективен и неточен, так как на результат реакции сильно влияют ее условия. И можно получить разные спектры для одного и того же образца.

2) SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) – маркер, который можно создать на основе RAPD. Сначала проводят ПЦР с RAPD- праймером и получают спектры фрагментов у разных образцов, сравнивают их и ищут потенциально интересные фрагменты. После этого их вырезают из геля, очищают и секвенируют (определяют нуклеотидную последовательность). После чего разрабатывают специфические праймеры для этого фрагмента. В итоге, получается воспроизводимый и более простой маркер чем RAPD (Paran, 1993).

3) RFLP (Restriction fragment length polymorphism) – геномная ДНК разрезается специфичными ферментами рестрикции, полученные фрагменты разделяются с помощью гель-электрофореза.

4) AFLP (Amplified fragment length polymorphism) – метод, основанный на разрезании всей геномной ДНК ферментами рестрикции (как и RFLP), последующем присоединении к получившимся фрагментам адаптеров и их амплификации (ПЦР). В результате получается набор фрагментов, отличающихся у разных образцов, если у них (у образцов) было разным количество и месторасположение сайтов рестрикции используемых ферментов. В дальнейшем фрагменты можно отсеквенировать – прочитать их нуклеотидную последовательность. Метод надежный, чувствительный, применяется на уровне всего генома, хорошо воспроизводится, позволяет создавать генетические карты, используется для построения филогенетических деревьев, правда, на уровне таксонов высокого порядка (рода, семейства), но в то же время весьма трудоемок.

5) SNP (Single nucleotide polymorphism) – однонуклеотидные замены. Могут присутствовать в генах и обуславливать различия в синтезируемом белке и, соответственно, в выполняемых функциях и фенотипе вообще (наиболее яркий пример – серповидно-клеточная анемия, обусловленная заменой в гене гемоглобина одного нуклеотида, что приводит к замене аминокислоты в белке). Но нуклеотидная замена может быть нейтральной и не влиять на функции белка. Кроме того, она может располагаться в некодирующей область и вообще ни на что не влиять. Однонуклеотидный полиморфизм широко используется для филогенетических исследований и в качестве видоспецифичного маркера.

Например, у разных видов лиственниц есть SNP в гене rbcL, кодирующем очень важный белок – большую субъединицу РУБИСКО – ключевой фермент фотосинтеза. У даурской лиственницы в 763 позиции находится гуанин, а у сибирской и архангельской лиственниц 8 – аденин. Лиственницы относятся к хвойным деревьям с очень длинным жизненным сроком и, соответственно, с длинным ювенильной жизненной стадией, на которой определение видов и гибридов по морфологическим сильно затруднено. Однако, исследовать ДНК можно на любой стадии развития, чем пользуются при проверке посадочного плантационного материала, чтобы внезапно не обнаружить, что в течение 20 лет выращивали не то дерево. Детектировать SNP можно разными методами. Например, просто секвенировать нужный участок. Однако, это достаточно дорого, особенно при наличии большого числа образцов. К тому же при секвенировании существуют погрешности, которые нивелируются статистически, при повторном прочтении той же последовательности (в случае секвенирования методами “следующего поколения” повторы достигают тысяч раз).

Другой вариант – создание CAPS-маркера. Если замена происходит в сайте рестрикции какой-либо рестриктазы, то при замене рестриктаза перестает его узнавать, следовательно, уже не может его разрезать. Так же можно использовать некоторые модификации метода ПЦР, заточенные под поиск однонуклеотидных замен.

6) Делеции в генах – выпадение участка гена, что приводит к его выключению. Детектировать делеции можно так же как SNP. Если делеция большая, то можно использовать метод электрофореза в полиакриламидном геле, с его высокой разрешающей способностью сравнивать размеры фрагментов ДНК. Более точные методы для определения размеров – фрагментный анализ и капиллярный электрофорез.

7) SSR (simple sequence repeats), микросателлиты – короткие тандемные повторы. Многочисленные повторы коротких мотивов длиной 2-10 нуклеотидов. Например, (ATGATGATGATG…)х20 (Hajeer et. al., 2000). Это очень полиморфные, быстро эволюционирующие участки. Из-за их строения велик шанс, что при репликации ДНК-полимераза вставит лишний повтор или, наоборот, на один меньше. Обычно они располагаются в некодирующих участках, но могут находиться и в генах. Печально известный пример – нейродегенеративное заболевание хорея Хантингтона, проявление которого зависит от количества повторов CAG в гене Htt. У большинства человек количество повторов 10-15. Однако, если повторов 39 или больше, то примерно к середине жизни человек начинает деградировать и преждевременно умирает. Возраст проявления и скорость развития болезни зависит от количества повторов. Если их 40, то к 59 годам человек уже будет безумен, 41 – к 54 годам, 50 – проявится уже в 27 лет.

8) ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) – метод, при котором проводится ПЦР с праймерами, соответствующими 10 последовательности микросателлитного повтора. Например, ACACACACACACA… Таким образом, амплифицируется последовательность между двумя одинаковыми микросателлитными локусами. Метод схож с RAPD, но является более специфичным (Лебедева и др.,2016).