 |
ЗАНЯТИЕ 2 («Хроматографическое разделение аминокислот. Высаливание белков. Количественное определение белков»)
|
|
|
|
Цель занятия: 1) ознакомиться с физико-химическими свойствами белков (молекулярная масса, растворимость, электролитические свойства, денатурация, амфотерность), с видами связи аминокислот в белковой молекуле, со строением полипептидной цепи, её пространственной структурой и химическими связями, поддерживающими пространственную конфигурацию, с классификацией белков, с важнейшими представителями простых белков; 2) выполнить лабораторную работу по осаждению белков высаливанием, определить количество белка в исследуемой жидкости; 3) познакомиться с простейшим приёмом хроматографического разделения аминокислот.
Студент должен знать следующее:
1. Почему для определения молекулярной массы /ММ/ белков неприемлемы эбулиоскопический и криоскопический методы.
2. Принципы осмометрического и диффузионного методов, принцип метода ультрацентрифугирования.
3. Принцип и технические приёмы гель-фильтрации.
4. Чем обусловлена растворимость белка в воде, какие факторы или воздействия её изменяют, содержание термина «высаливание», в каких целях используется высаливание.
5. Понятия «нативный» и «денатурированный» белок, виды денатурирующих воздействий; изменения, происходящие при денатурации, а также разницу между коагуляцией (осаждением) и денатурацией.
6. От чего зависит заряд белковой молекулы, значение понятий «изоэлектрическая точка» и «изоэлектрическое состояние».
7. Принцип разделения аминокислот хроматографическими методами.
8. Принципы классификации соединений белковой природы в зависимости от состава (наличие или отсутствия компонентов, не являющихся аминокислотами).
9. Классификацию простых белков (протеинов), в частности, простых белков животного организма
|
|
|
Студент должен уметь:
1. Различать по данным о качественном составе белковой молекулы простые и сложные белки.
2. Различать на основании данных об аминокислотном составе и о молекулярной массе /ММ/ протеины и полипептиды.
3. Рассчитать ММ простого белка по его аминокислотному составу.
4. Ориентировочно (на уровне «растворим» или «плохо растворим») прогнозировать растворимость белка в воде по данным об его аминокислотном составе.
Студент должен получить представление:
1. О принципах определения молекулярной массы белков методом гель-фильтрации и ультрацентрифугирования,
2. Об использовании в медицинской практике свойства белков осаждаться тяжелыми металлами,
3. О том, как используют данные об электрофоретической подвижности белков в диагностических целях,
4. О значении данных об аминокислотном составе пищевых белков как критерия полноценности рационов питания.
Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения т емы:
1) расчет ММ по структурной формуле соединения,
2) сведения о «гидратной» воде,
3) сведения об осмотическом давлении, его связи с ионным составом и концентрацией ионов,
4) сведения о реакциях гидролиза,
5) понятие о началах термодинамики,
6) сведения о принципе и технике колориметрии и нефелометрии.
Аудиторная работа
Лабораторная работа (Х роматографическое разделение аминокислот - демонстрация прибора и хроматограммы. Высаливание белков, их количественное определение )
1. Высаливание белков сыворотки крови сульфатом аммония может использоваться для разделения альбуминов и глобулинов, так как глобулины осаждаются при 50%-ном насыщении сульфатом аммония, а альбумины - при 100%-ном насыщении.
Ход работы. В пробирку внести 2 мл сыворотки крови и прибавить столько же насыщенного раствора сульфата аммония. Образующийся осадок отфильтровать - на фильтре при этом останутся глобулины. К фильтрату добавить сухого тонко измельченного порошка сульфата аммония до насыщения. Образующийся при этом осадок, представленный альбуминами, отделить фильтрованием.
|
|
|
Высаливание сульфатом аммония обратимо. В этом можно убедиться, поместив фильтры с осадком белка в воду - происходит растворение осадка.
2. Количественное определение белка в моче основано на реакции осаждения белка сульфосалициловой кислотой и определении мутности осадка (нефелометрическое определение).
Ход работы:
А. Опытная проба - 1) в центрифужную пробирку внести 1.25 мл фильтрата мочи и добавить до 5 мл раствора сульфосалициловой кислоты; 2) экспонировать 5 мин; 3) внести пробу после экспозиции в кювету (10 мм) фотоэлектроколориметра и определить (против воды) плотность образовавшейся мути, используя оранжевый фильтр.
Б. Контрольная проба: внести в центрифужную пробирку вместо сульфосалициловой кислоты 1,25 мл дистиллированной воды и далее воспроизвести пункты 2- и 3 основного опыта.
Найти разницу между оптической плотностью опытной и контрольной проб и учесть результат по калибровочному графику.
Представленный график (см. следующую страницу) построен по результатам определения оптической плотности растворов альбумина с известной концентрацией при добавлении к ним сульфосалициловой кислоты: на оси абсцисс отложены значения концентраций белка (в %), на оси ординат – значения оптической плотности (единица измерений - экстинкции).
0.4
 |
0.20
0.12
0.04
0.1 0.25 0.50 1.0 С, %
|
|
|
