Особенности иммерсионной микроскопии

При иммерсионной микроскопии окрашенных препаратов необходимо создавать хорошее освещение, для чего надо максимально поднять конденсор, открыть диафрагму конденсора, поставить малый сухой объектив на расстоянии 5–7 см от предметного столика и с помощью плоского зеркала установить равномерное освещение поля зрения. При работе с иммерсионной системой во избежание порчи объектива необходимо соблюдать следующие правила: после нанесения на поверхность препарата небольшой капли иммерсионного масла под контролем глаза сбоку погрузить в нее фронтальную линзу иммер​сионного объектива, а затем, глядя в окуляр, при помощи сначала макрометрического, а затем микрометрического винта установить препарат в фокусе микроскопа. Микроскопирование необходимо про​водить, не сни​мая руки с микрометрического винта, что дает воз​можность, изменяя фокусное расстояние, рассмотреть всю поверх​ность поля зрения. После работы иммерсионная система и столик микроскопа должны быть очищены от масла.

3.Виды микроскопии
Микроскопия в темном поле. Ее применяют для изучения неокрашенных микробов, их подвижности. Этот метод микроскопии требует специального конденсора с затемненной цент​ральной частью, которая, задерживая центральную часть пучка лу​чей, пропускает лишь боковые косо направленные лучи. В связи с этим поле зрения остается неосвещенным в то время как объекты, находящиеся в препарате, ярко светятся на темном фоне.
  Люминесцентная микроскопия. Люминесценция – свечение объекта, возбуждаемое поглощенной световой энергией (коротковолновая и ультрафиолетовая части спектра). Мик​робы обладают слабой собственной первичной люминесценцией, и по​этому на практике пользуются наведенной люминесценцией путем обработки объекта растворами люминесцирующих красителей (флюорохромами), которые светятся под влиянием ультрафиолетовых и коротковолновых синих лучей. Отдельные флюорохромы обладают избирательностью, т.е. связываются с отдельными клеточными структурами (ядро, цитоплазма, включения). Для люминесцентной микроскопии необходим источник ультрафиолетового света и набор светофильтров.

Фазово-контрастная микроскопия. Изучение живых неокрашенных микробов затруднено в связи с их ма​лой контрастностью. В видимом свете они прозрачны. Однако при про​хождении света через микробную клетку происходит изменение фазы световых лучей, что обусловлено различиями толщины и показателей преломления отдельных структур. Эти изменения могут быть обнаруже​ны при использовании специальных фазово-контраст​ных устройств, в результате чего микроорганизмы и отдельные части микробной клет​ки становятся контрастными и видимыми человеческим глазом.
В электронном микроскопе вместо световых лучей ис​пользуется поток электронов, излучаемых специальным источником (электронная пушка). На пути потока электронов помещены электро​магнитные линзы, которые для электронных лучей являются фокусирую​щими, т.е. действуют подобно линзам для световых лучей. Исследуе​мый препарат, приготовленный на тончайшей пленке, помещают в без​воздушной среде на пути потока электронов после их прохождения через конденсорную линзу. Затем пучок электронов проходит через объективную и проекционные линзы. Изображение микроскопируемого объекта наблюдают на флюоресцирующем экране. Возникновение изображения на экране обусловлено тем, что различные части исследуемого объекта обладают неодинаковой проницаемостью для электронов.Электронная микроскопия дает возможность изучать объекты вели​чиной 10–10000 нм. Ее широко применяют для исследования тончайших структур бактериальной клетки и функциональных особенностей ее компонентов, для изучения морфологии и биологических свойств вирусов и фагов.
В сканирующем зондовом микроскопе используют комбинации инвертированного оптического и зондового микроскопов. Минимальный шаг сканирования составляет 0,01нм. Сканирующая зондовая микроскопия применяется для определения плотности и размеров бактерий и вирусов, определения параметров состояния мембран (эластичности, проводимости), исследования структуры ДНК, особенностей биомакромолекул и антигенов поверхности клеток.
4.Препарат висячая капля. Значение
Приготовление препарата «висячая капля»
На середину покровного стекла нанести каплю исследуемой жид​кой культуры. Каплей вниз опустить покровное стекло на предметное стек​ло с углублением (лункой), края которого смазаны вазелином. Кап​ля должна свободно свисать и не касаться дна краев углубления. Создается герметически закрытая камера, в которой бактерии можно наблюдать длительное время (4–6 часов). При малом увеличении найти край кап​ли, после чего переместить ее в центр поля зрения и микроскопировать с объективом сильного увеличения и с иммерсионным объективом.
5.Приготовление препарата «раздавленная капля»
На середину предметного стекла нанести каплю жидкой бактери​альной культуры. Осторожно накрыть её покровным стеклом, чтобы не было пузырьков воздуха, после чего микроскопировать с малым сухим, а затем с большим сухим и иммерсионным объективами.

6. Прижизненная окраска бактерий
Для такой окраски применяются сильно разбавленные растворы кра​сителей, которые не оказывают токсического действия на бактерии. На предметное стекло нанести каплю 0,001 % раствора метиленового синего, в которую внести взвесь бактерий, после чего приготовить препарат «раздавленная капля» и микроскопировать его.

7. Приготовления фиксированного мазка и простой способ окрашивания. Значение. Для приготовления мазка на чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю физиологического раствора, в которую петлей вносят исследуемый материал с плотной питательной среды и распределяют так, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1–1,5 см. При приготовлении мазков из жидких культур исследуемый материал непосредственно наносится на предметное стекло.
Фиксация мазка производится с целью прикрепления микроорганизмов к стеклу и обеззараживания препарата. Кроме того, фиксированные бактерии лучше воспринимают красители. Для фиксации мазков высушенный препарат проводят 3–4 раза через пламя горелки, причём в пламени препарат следует выдерживать не более 2 секунд. Если фиксация проведена правильно, стекло при прикосновении к тыльной поверхности руки тотчас после окончания процесса фиксации слегка обжигает кожу. В некоторых случаях мазки можно фиксировать путем погружения в этиловый спирт на 15–20 минут, в смесь равных объёмов этилового спирта и эфира (смесь Никифорова) на 15–20 минут, в ацетон на 5 минут.
Окрашивание мазков осуществляется растворами анилиновых красителей. В основе окраски лежат сложные химические и физико-химические процессы взаимодействия компонентов микробной клетки с анилиновыми красителями. Красящая способность последних зависит от наличия у них карбоксильных, серосодержащих аминогрупп, от заряда микробной клетки. Для окраски микроорганизмов используют главным образом основные красители​​ – метиленовый синий, кристаллический фиолетовый, генциан фиолетовый, фуксин, гематоксилин, везувин и др. Для выявления различных структурных элементов бактериальной клетки применяют нейтральные и кислые красители​​ (нейтральный красный, кислый фуксин, Конго, пикриновая кислота и др.). Отношение микроорганизмов к красителям определяет их тинкториальные свойства.

8. Принцип техники окраски по Граму
Техника окраски по Граму
а) на фиксированный препарат поместить полоску фильтровальной бумаги и на неё нанести раствор​​ карболового генцианвиолета на 1–2 минуты;
б) краситель слить, снять фильтровальную бумагу и обработать препарат в течение 1–2 минут раствором Люголя до почернения препарата;
в) слить раствор Люголя и на препарат нанести несколько капель этилового спирта на 30–60 сек;
г) промыть водой и докрасить препарат водным фуксином в течение
1–2 минут;
д) слить краску, промыть водой, высушить и микроскопировать препарат с иммерсионной системой.
При данном методе одни бактерии окрашиваются в тёмно-фиолетовый цвет (грамположительные), другие – в красный или розовый (грамотрицательные). Сущность метода состоит в том, что клеточная стенка грамположительных бактерий прочно фиксирует комплекс «генцианвиолет – раствор Люголя», не обесцвечивается этанолом и потому не воспринимает дополнительный краситель (фуксин). У грамотрицательных микробов комплекс легко вымывается из клетки этанолом, и они окрашиваются дополнительным красителем.

9. Выявление капсул по методу Бурри – Гинса

а) на край предметного стекла нанести каплю туши, а рядом каплю исследуемой культуры. Капли быстро перемешать и с помощью шлифованного стекла приготовить тонкий мазок;
б) после высушивания мазок фиксировать над пламенем и окрасить фуксином в течение 1–2 минут;
в) осторожно промыть водой и высушить.
Бактерии окрашиваются в красный цвет, капсула не окрашивается и имеет вид светлой зоны вокруг бактерий на тёмном фоне.

10. Окраска включений волютина по методу Нейссера
Приготовить мазок и окрасить по методу Нейссера для выявления зёрен волютина, микроскопировать:
а) фиксированный мазок окрасить в течение 2–3 минут уксусно-кислой синькой Нейссера;
б) препарат 10–30 секунд обрабатывать раствором Люголя;
в) не промывая водой, мазок докрасить в течение 30–60 секунд везувином.
Зёрна везувина окрашиваются в синий цвет, тела клеток – в жёлтый.

11.Окраска жгутиков по методу Леффлера

а) приготовить мазок из 18–24-часовой культуры, для чего взвесь бактерий внести в каплю стерильной водопроводной воды, нанесенной на предметное стекло, и высушить;

б) мазок обработать в течение 15–20 минут протравой, содержащей
1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина, 10 мл 25 % водного раствора танина и 5 мл насыщенного водного раствора серно-кислого железа;

в) мазок тщательно промыть водой, высушить на воздухе и докрасить фуксином Циля в течение 3–4 минут при легком подогревании;

г) препарат промыть водой и высушить.

12.Выявление спор способом Ожешки

а) приготовить мазок на краю предметного стекла;

б) нефиксированный мазок подвергнуть протравливанию кислотой при повышенной температуре, для чего на мазок налить 1 % раствор соляной кислоты и подогреть над пламенем горелки в течение 2–3 минут;

в) кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем.

При такой обработке оболочка споры размягчается и становится доступной для красителя. Далее мазок 13. окрасить по методу Циля – Нильсена:

а) на мазок поместить кусочек фильтровальной бумаги, на него налить карболовый фуксин Циля и подогреть стекло над пламенем горелки до появления паров;

б) охладить, снять бумагу, промыть водой и обесцветить 5 % серной кислотой в течение 30 секунд;

в) препарат тщательно промыть водой и докрасить раствором метиленового синего в течение 3–5 минут;

г) препарат промыть водой и высушить.

Карболовая кислота разрыхляет оболочку споры и тем самым повышает её тинкториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодействия бактериальных спор с красителями. Споры окрашиваются в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой вегетативные тела бактерий обесцвечиваются метиленовым синим.