 |
Разделение и идентификация красителей в их смеси. Методика выполнения работы.
|
|
|
|
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3
Тема. Идентификация и разделение пищевых красителей методами тонкослойной и бумажной хроматографии.
Цель работы: Ознакомиться с методом разделения веществ с помощью тонкослойной и бумажной хроматографии с целью их идентификации.
Техника безопасности: Выполнять правила техники безопасности при работе со стеклянной посудой и растворами веществ.
Оборудование; посуда, растворы и реактивы: сушильный шкаф, шпатель, камера для хроматографирования капилляры, силикагель, гипс CaSO4 2H2O (для анализа), крахмал растворимый, силуфоловая пластинка (тонкий слой силикагеля, закрепленный крахмалом на алюминиевой фольге), подвижный растворитель: дистиллированная вода.
К поверхностным явлениям относят процессы, протекающие на границах раздела фаз и обусловленные особенностями состава и структуры поверхностей. Клетки, являющиеся основой строения любого организма, отличаются сильно развитой поверхностью раздела (биологические мембраны), на которой и осуществляются многие жизненно важные процессы. Особое значение для понимания механизма функционирования различных биологических структур имеет такое явление, как адсорбция.
Адсорбция - самопроизвольное изменение концентрации компонента системы в поверхностном слое. С процесса адсорбции начинается взаимодействие любых веществ с клетками и тканями организма (питательных и токсических веществ, лекарств и т. д.).
Взаимодействие ферментов с субстратами, антител с антигенами, поляризация и деполяризация биологических мембран — все эти явления не могут быть объяснены без применения закономерностей протекания адсорбционных процессов.
В медицине весьма широко применяется адсорбционная терапия, простейшие примеры которой — использование некоторых веществ, называемых адсорбентами (активированный уголь, гидроксид алюминия в составе препарата «альмагель» и др.), для связывания токсинов, нежелательных веществ, попадающих в желудочно-кишечный тракт. Одним из средств интенсивной детоксикации организма является гемосорбция — удаление из крови чужеродных организму веществ.
|
|
|
Наконец, в основе существующей в настоящее время системы регенерации воздуха и воды в закрытых циклах (подводная лодка, космический корабль, не загрязняющие среду производства) также лежат адсорбционные процессы.
Явление адсорбции лежит в основе такого ценного метода анализа многокомпонентных смесей, как хроматография. В общем случае под хроматографией понимают физико-химический метод анализа, основанный на различии в скорости движения разделяемых веществ относительно неподвижной фазы под действием подвижной. Различие в скорости движения связано с разной интенсивностью процессов сорбции и десорбции в системе подвижная фаза - неподвижная фаза. По технике эксперимента различают колоночную хроматографию (разновидность — капиллярная хроматография) и плоскостную - тонкослойная хроматография, хроматография на бумаге.
Особенно большое значение для медицины имеет молекулярно-ситовая хроматография, позволяющая разделить на фракции биомакромолекулы (например, белки).
ПРИНЦИП МЕТОДА
Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) - один из видов жидкостной (распределительной) хроматографии. В этом методе разделение веществ основывается на распределении их между двумя фазами, одна из которых находится на твердом носителе. В качестве сорбента используют оксид алюминия, силикагель, ионообменные смолы и др., нанесенные на пластинку. При разделении веществ в тонком слое носителя можно использовать принципы адсорбционной, распределительной и ионообменной хроматографии. В тонкослойной хроматографии используют такие хроматографические системы: жидкость - твердый сорбент и жидкость -жидкость - твердый сорбент.
|
|
|
Положение пятен (зон) веществ, которые разделяются на хроматограмме, характеризуются величиной Rf
| Rf = | смещение фронта вещества |
| смещение фронта растворителя |
Эта величина определяется экспериментальным соотношением:
,
где l - расстояние, которое пройдено анализируемым веществом, см;
L - расстояние, которое пройдено растворителем, см.
Величина Rf характерна для исследуемого соединения на данном сорбенте и в данных условиях эксперимента. Значение Rf зависит от активности и качества сорбента, от толщины слоя сорбента, от качества и природы растворителя, от количества нанесения вещества и от способа работы.
 |
Схема разделения смеси веществ на пластинке с тонким слоем носителя
Рис. 1. L, l1, l2-высота подъема растворителя, а также первого и второго компонента смеси
А - место нанесения капли раствора красителей;
1 и 2 - индивидуальные вещества (свидетели);
3 - смесь веществ 1 и 2, которые должны быть разделены.
На слой сорбента на стартовую линию наносят пробы растворов веществ и их смеси. Пластинка опускается с наклоном в жидкость так, чтобы стартовая линия была немного выше уровня растворителей. Пластинка остается в хроматографической камере до тех пор, пока жидкость поднимется на такую высоту, что не дойдет I - 2 см до края пластинки. Границу, на которую поднимется жидкость, отмечают карандашом, пластинку высушивают и проявляют. Раствор смеси веществ, которые разделяют, и метки (свидетели) наносят на стартовую линию на расстоянии 2 см от края пластинки. Расстояние между отдельными пятнами должно быть не менее, чем 1,5 - 2 см. По технике выполнения выделяют восходящую, нисходящую и горизонтальную тонкослойную хроматографию. Наиболее распространена восходящая тонкослойная хроматография. Перед бумажной тонкослойная хроматография имеет преимущество в скорости выполнения анализа. Методом ТСХ были исследованы магнитные фракции космической пыли.
Разделение и идентификация красителей в их смеси. Методика выполнения работы.
|
|
|
На пластинке на расстоянии 1,5 см от края отмечают стартовую линию. 3 правый угол пластинки (расстояние от края 2 см) наносят осторожным прикосновением пипетки или специально изготовленным капилляром каплю исследуемого раствора. Через 1,5 см по ширине пластинки наносят еще каплю исследуемого раствора для параллельного опыта и дальше через каждые 1,5 см по капле свидетелей - растворов красителей. Диаметр пятна должен быть не более чем 2 мм. Пластинку высушивают и помещают в вертикальном положении в камеру для хроматографирования, опуская осторожно, нижний край пластинки в подвижный растворитель 0,5-1 см. Сверху камеру закрывают пришлифованной крышкой и оставляют для получения хроматограммы. После того, как растворитель поднимется по тонкому слою носителя до уровня, не достигающего 2 см до верхнего края; пластинку достают и высушивают под вытяжным шкафом. После высушивания хроматограммы определяют Rf для красителей и компонентов смеси:
Rf= l/L
Анализ можно выполнять на полоске силуфоновой пластинки шириной 1,5-2 см, определив таким образом состав смеси, а далее проводить идентификацию, сравнивая значения Rf компонентов смеси со значениями Rf полученными таким же путем для каждого красителя отдельно.
Как модельные растворы смесей красителей могут быть предложены такие смеси, представленные в табл. 1. Для работы готовят 0,05 % водные растворы красителей, кроме бриллиантового зеленого, который готовят на спирте.
Таблица 1 Смеси красителей
феноловый красный - метиловый кристаллический;
бромфеноловый красный - -׀׀-
активный ярко-голубой - -׀׀-
метиловый оранжевый - -׀׀-
феноловый красный - бриллиантовsй зеленый;
бромфеноловый красный- -׀׀-
активный ярко-голубой - -׀׀-
метиловый оранжевый - -׀׀-
феноловый красный - активный ярко-голубой - метиловый
кристаллический
бромфеноловый красный - -׀׀-
метиловый оранжевый - -׀׀-
Тонкослойная хроматография находит широкое применение в анализе объектов окружающей среды- воздуха, почвы, воды и др. с целью предупреждения загрязнения, а также при анализе органических соединений, в фармакологии, клинической диагностике и др. ТСХ используют также для обнаружения и полуколичественного определения следовых количеств синтетических пестицидов. Пятна пестицидов обнаруживают опрыскиванием пластинки специальными реактивами.
|
|
|
Метод бумажной хроматографии
Разделение веществ происходит вследствие распределения их между неподвижной водной фазой, находящейся на поверхности бумаги, и подвижной фазой. Как подвижную фазу обычно используют органические растворители или их смеси, которые не должны смешиваться с водой. Установлено, что в отдельных случаях может быть использована вода в качестве подвижной фазы. Бумажную хроматографию можно получить путем восходящего, нисходящего, горизонтального или радиального движения растворителя. Нанесенные на хроматографическую бумагу вещества, когда фронт растворителя подходит к месту, где находится исследуемая смесь, переходят в подвижную фазу и, двигаясь с различными скоростями вместе с растворителем под действием капиллярных сил, распределяются, оставаясь на различных частях бумажной полоски. После разделения хроматограмму снимают, высушивают, потом проявляют- обрабатывают из пульверизатора растворами реагентов, образующими окрашенные соединения с веществами, входящими в смесь. По цвету окраски определяют качественный состав. Если компоненты окрашены, то после высушивания проявлять их нет надобности.
Методика выполнения работы.
На полоску фильтровальной бумаги шириной 1,5 см, длиной 20 см на расстоянии 2 см от нижнего края проведем стартовую линию и нанесем по центру каплю исследуемого раствора. Это делается прикосновением капилляра к бумаге. Диаметр пятна должен быть приблизительно 3 мм. Бумагу высушивают.
Полоску бумаги с каплей исследуемого раствора помещают в хроматографическую камеру так, чтобы ее конец был погружен в подвижный растворитель на 0,5 см. В качестве подвижного растворителя используется дистиллированная вода. Бумажная полоска не должна касаться стенок хроматографической камеры и других полосок, расположенных в этой камере.
Процесс хроматографирования заканчивается, когда растворитель поднимается не менее чем на 10 см. Время хроматографирования смеси красителей - около 20 минут. Бумагу потом вынимают, отмечают карандашом положение фронта растворителя и высушивают на воздухе. Измеряют расстояние между стартовой линией (место нанесения пробы) и фронтом растворителя L, а также расстояния, пройденные компонентами пробы (l1 и l2), которые качественно определяют по их окраске и рассчитывают Rf. Полученные значения Rf сравнивают со значениями, полученными таким же путем отдельно для каждого компонента смеси красителей.
|
|
|
ЛИТЕРАТУРА
1.Курс лекций по аналитической химии. Донецк: ДонНУ, 1993.
2.Пилипенко А.Т., Пятницкий И.В. Аналитическая химия: В 2-х книгах: - М.:Химия, 1990. - 846 с.
3.Набиванец Б.И., Мазуренко Е.А. Хроматографический анализ. - Киев: Вища школа, 1979.- 264 с.
4. Бабко А. К. Пятницкий И. В. «Качественный анализ» - К.: Вища школа.
|
|
|
