 |
Показатели цитокинового статуса
|
|
|
|
I. Самоподготовка к практическому занятию
1) Студент должен самостоятельно изучить материал согласно ниже приведенной программе.
Программа учебного материала
Характеристика основных показателей адаптивного клеточного иммунитета (субпопуляции лимфоцитов, функциональные показатели лимфоцитов). Значение этих показателей в клинической практике.
Характеристика гуморального иммунитета (В-лимфоциты, концентрация иммуноглобулинов). Значение этих показателей в клинике.
Дифференцировка Т- и В-лимфоцитов, система кластеров дифференцировки и методы их определения. Митогениндуцированная пролиферативная активность лимфоцитов как показатель функциональной активности лимфоцитов.
Определение фагоцитарной активности нейтрофилов и макрофагов. Исследование завершенности фагоцитоза (тест восстановления нитросинего тетразолия – НСТ-тест).
Условия образования патогенных циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Методы определения концентрации ЦИК.
История создания нового направления в биологии и медицине – биотехнологии. Принципы получения гибридом, секретирующих МКАТ заданной специфичности. Области применения МКАТ и перспективы их использования в будущем.
Тесты иммунологического исследования - количественные (I уровня) и функциональные (II уровня). Иммунограмма.
2) Рекомендуемая литература
Основная
| № | Название |
| 1. | Хаитов, Р.М. Иммунология /Р.М.Хаитов - М., «ГЭОТАР-МЕДИА», 2010. – 520 с. |
| 2. | Патофизиология. В 3 т.: чебник для студентов учреждений высш. Мед. проф. образования /под ред. А.И..Воложина, Г.В.Порядина. – 3-е изд., стер. – М.: Изд.центр «Академия», 2010. |
Дополнительная
| № | Название |
| 1. | Карзакова, Л.М. Основы клинической иммунологии: учебное пособие для студентов стоматологических факультетов/Л.М.Карзакова. – Чебоксары: Изд-во Чуваш. Ун-та, 2011. – 312 с. |
| 2. | Карзакова, Л.М. Иммунодиагностика и иммунотерапия в клинике внутренних болезней (учебное пособие) /Л.М.Карзакова.- Чебоксары: Изд-во Чуваш. ун-та, 2006. – 150 с. |
| 3. | Карзакова, Л.М. Цитокины в норме и при патологии/Л.М.Карзакова // Здравоохранение Чувашии. – 2009. - №2. – С.74-82. |
| 4. | Афанасьев, Б.В.Гематология: Руководство для врачей/ Б.В. Афанасьев, О.Я. Волкова, А.А. Галапиев. - СПб: СпецЛит, 2008. |
| 5. | Семченко, И. М. "Пузырные" поражения слизистой оболочки полости рта: учебно-методическое пособие / И. М. Семченко, И. А. Пищинский; Белорус. гос. мед. ун-т. - Минск: БГМУ, 2008. - 30с. |
|
|
|
Внеаудиторная работа
Вопросы для самоподготовки
1. Какие иммунологические тесты относят к I уровню?
2. Какие тесты относят ко II уровню?
3. Назовите показания для проведения тестов II уровня.
4. Показатели иммунограммы, характеризующие адаптивный клеточный иммунный ответ.
5. Показатели иммунограммы, характеризующие гуморальный антигенспецифический иммунный ответ.
6. Какие иммунологические тесты дают информацию о фагоцитарном звене иммунитета?
7. Назовите минимальный спектр цитокинов, достаточных для определения функций основных звеньев иммунной системы.
8. Каковы принципы иммунофенотипирования клеток?
9. Назовите метод для определения концентрации Ig трех основных классов (IgM, IgG, IgA).
10. Какой метод используют для определения IgE?
11. Охарактеризуйте сущность метода определения циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК).
12. Каким методом лабораторного микроанализа исследуют цитокины (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, ФНОα, ИФН-γ)?
13. Назовите метод определения функциональной активности Т-лимфоцитов.
14. Назовите этапы проведения реакции ФГА-индуцированной лимфопролиферации – реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ).
|
|
|
15. Какие показатели характеризуют фагоцитарную активность нейтрофилов?
16. Назовите тест, оценивающий завершенность фагоцитоза.
17. Назовите современные методы микроанализа.
18. Назовите отличие моноклональных антител (МКАТ)от поликлональных антител.
19. Как определяется иммунорегуляторный индекс?
20. Назовите методы исследования апоптоза клеток.
21. Назовите активационный маркер (CD), характеризующий раннюю стадию активации мононуклеарных клеток.
22. Перечислите активационные маркеры поздней активации мононуклеаров.
23. Назовите провоспалительные цитокины.
24. Какие цитокины относятся к разряду противовоспалительных?
25. Перечислите цитокины, способные усилить апоптоз Т-клеток.
26. Экспрессия какого CD антигена свидетельствует о готовности лимфоцитов к активационно-индуцированному апоптозу?
27. Назовите способы оценки результатов реакции иммунофлуоресценции (для определения фенотипа лимфоцитов) с использованием моноклональных антител.
28. Дайте определение термину «CD-антиген».
Письменные задания
1. Перерисуйте в рабочую тетрадь табл.1 и отметьте в соответствующих
графах методы определения и нормальные значения показателей иммунограммы.
Таблица 1
Показатели иммунограммы, методы их определения и нормальные значения
| Показатель иммунограммы | Метод определения | Нормальные значения |
| Т-лимфоциты | ||
| Т-хелперы | ||
| Цитотоксические Т-лимфоциты | ||
| Иммунорегуляторный индекс | ||
| В-лимфоциты | ||
| IgM | ||
| IgG | ||
| IgA | ||
| IgA | ||
| IgE | ||
| Фагоцитарный индекс | ||
| Фагоцитарное число | ||
| НСТ-тест | ||
| ЦИК |
2. Перерисуйте в рабочую тетрадь табл.2 и перечислите маркеры, экспрессирующиеся на приведенных в первом столбце клеточных популяциях.
Таблица 2
| Клетки | CD маркеры |
| Т-лимфоциты | |
| В-лимфоциты | |
| Нейтрофилы | |
| Клетки моноцитарно-макрофагального ряда | |
| NK |
3. Перерисуйте в рабочую тетрадь табл.3
Таблица 3
Показатели цитокинового статуса
| Цитокин | Характеризуемая функция |
| Интерлейкин-1β (ИЛ-1 β) | Tх1, Tх2 |
| Интерлейкин-2 (ИЛ-2) | Tх1 |
| Гамма-интерферон (ИФН-γ) | Tх1 |
| Фактор некроза опухоли-α (ФНОα) | Tх1 |
| Интерлейкин-4 (ИЛ-4) | Tх2 |
| Интерлейкин-5 (ИЛ-5) | Tх2 |
| Интерлейкин-8 (ИЛ-8) | Хемотаксис, активация нейтрофилов и макрофагов |
| Интерлейкин-10 (ИЛ-10) | Tх2 (cупрессия Tх1) |
|
|
|
4. Перерисуйте в рабочую тетрадь схему специфического связывания клетки с МКАТ и окрашивания антителами, меченными ФИТЦ. Отметьте на рисунке-схеме элементы, соответствующие цифрам 1, 2, 3, 4
 |
5. Перерисуйте в рабочую тетрадь схему фагоцитоза. Отметьте на рисунке-схеме сегментоядерный нейтрофил, частицы латекса.
6. Перерисуйте в рабочую тетрадь табл.4
Таблица 4
Показатели иммунного статуса здоровых жителей Чувашии
(по Карзаковой Л.М., 2005)
| Показатель | Предел колебаний* | |
| Лейкоциты | 109/л | 4,7-6,4 |
| Нейтрофилы | % | 55,5-62,0 |
| 109/л | 2,59-3,82 | |
| Лимфоциты | % | 33,5-40,5 |
| 109/л | 1,6-2,34 | |
| Т-лимфоциты (CD3+) | % | 58,0-65,5 |
| 109/л | 0,94-1,48 | |
| Т-хелперы (CD4+) | % | 34,0-40,5 |
| 109/л | 0,56-0,91 | |
| Цитотоксические Т-лимфоциты (CD8+) | % | 22,0-26,0 |
| 109/л | 0,38-0,55 | |
| CD4+/CD8+ | 1,4-1,63 | |
| Лимфоциты, несущие рецептор к IL-2 (CD25+) | % | 5,2-8,0 |
| 109/л | 0,09-0,17 | |
| 109/л | 0,30-0,41 | |
| Клетки, несущие Fas-рецептор апоптоза (CD95+) | % | 17-21 |
| 109/л | 0,30-0,46 | |
| В-лимфоциты (CD20+) | % | 10-17 |
| 109/л | 0,19-0,34 | |
| IgM | г/л | 1,05-1,35 |
| IgG | г/л | 10,6-12,5 |
| IgA | г/л | 1,57-2,1 |
| ЦИК | у. е. | 12-20 |
| NK-клетки (CD16+) | % | 12-17 |
| 109/л | 0,22-0,43 | |
| Фагоцитарный индекс | % | 59-67 |
| Фагоцитарное число | 3,7-4,8 | |
| НСТ-тест | % | 10-14,5 |
Примечание: * - предел колебаний включает значения интервала Р25 – Р 75 (нижний квартиль – верхний квартиль)
7. Перерисуйте в рабочую тетрадь фракции клеток после их разделения в результате центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина
Эталоны ответов на тест-вопросы для самостоятельной подготовки и контроля
1.
· Подсчет числа лейкоцитов в камере Горяева или с использованием гемоанализатора;
· исследование лейкоформулы при окраске мазков крови азур-эозином;
· определение процентного и абсолютного числа Т-, В-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов методом прямой или непрямой иммунофлюоресценции с использованием МКАТ CD3, CD20, CD4, CD8;
|
|
|
· определение в сыворотке крови концентрации основных трех классов Ig – IgM, IgG, IgA в реакции радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини;
· исследование фагоцитарной активности нейтрофилов в латекс-тесте с определением фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа;
· определение концентрации ЦИК в сыворотке крови методом осаждения полиэтиленгликолем (Mm 6000).
2.
· Исследование функциональной активности Т-лимфоцитов в реакции ФГА-индуцированной лимфопролиферации;
· определение экспрессии активационных маркеров CD25, CD71, DR, CD95 на мононуклеарных клетках;
· исследование подклассов иммуноглобулинов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 в сыворотке крови в реакции Манчини.
3. В случае обнаружения клинических признаков приобретенной иммунологической недостаточности.
4.
· Число Т-лимфоцитов (CD3+);
· число Т-хелперов (CD4+) и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+);
· индекс стимуляции в ФГА-индуцированной лимфопролиферации;
· уровни спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-2, ИФН-γ, ФНОα в куль
туре лимфоцитов.
5.
· Число В-лимфоцитов (CD19+ или CD20+);
· концентрация IgM, IgG, IgA в сыворотке крови;
· исследование пролиферативной активности лимфоцитов на В-клеточный митоген (митоген лаконоса, полисахариды);
· уровни спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10 в культуре лимфоцитов;
· определение секреторного IgA.
6.
· Исследование фагоцитарной активности нейтрофилов или макрофагов в латекс-тесте;
· бактерицидная активность по НСТ-тесту.
· уточняющие тесты: интенсивность хемотаксиса (миграции) фагоцитов, исследование адгезивной способности нейтрофилов к пластику.
7. ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, ИФН-γ, ФНОα.
8. Иммунофенотипирование мононуклеарных клеток проводят с помощью МКАТ, конъюгированных с флуоресцирующим красителем (прямая реакция поверхностной иммунофлуоресценции), либо при помощи немеченых МКАТ, которые затем взаимодействуют с овечьими (или кроличьими) антителами против Ig мыши, меченными флуорохромами (непрямой метод иммунофлуоресценции). Непрямой метод более чувствителен по сравнению с прямым методом иммунофлуоресценции, в связи с чем он предпочтителен для иммунофенотипирования клеток.
Этапы реакции непрямого метода иммунофлуоресценции:
· выделение мононуклеарных клеток из периферической крови центрифугированием в фиколл-верографиновом градиенте;
· инкубация мононуклеаров (0,1х106 кл в 50 мкл) с 5 мкл тестируемого МКАТ в течение 30-45 мин при +4˚С;
· после отмывки в растворе Хенкса клетки инкубируют 30мин при +4˚С с 50 мкл флуоресцеина изотиоцианата (ФИТЦ) меченных овечьих антител к Ig мыши, разведенных 1:100;
|
|
|
· затем клетки дважды отмывают в растворе Хенкса, к осадку добавляют 50 мкл 1% параформальдегида;
· после этого клетки просматривают под иммерсией на флуоресцентном микроскопе.
9. Реакция радиальной иммунодиффузии в геле.
10. ИФА.
11. Исследуемая сыворотка вносится в две пробирки – опытную и контрольную. В опытную пробирку наливают раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ), в контрольную – буферный раствор. ПЭГ связывает ЦИК, что приводит к повышению оптической плотности опытной сыворотки. По разнице оптической плотности опытной и контрольной сывороток судят о концентрации ЦИК в исследуемой сыворотке.
12. ИФА.
13. ФГА-индуцированная пролиферация лимфоцитов (РБТЛ).
14.
· Выделение мононуклеарных клеток в градиенте плотности фиколла верографина в стерильных условиях;
· взвесь мононуклеаров культивируют в 150 мкл «полной культуральной
среды» (среды RPMI-1640, содержащей 10 % инактивированную
эмбриональную телячью сыворотку или сыворотку человека АВ(IV) группы, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES буфера, 40 мкг/мл гентамицина) в 96-луночных круглодонных планшетах при 37˚С в атмосфере 5 % СО2 в течение 72 ч в присутствии митогена – фитогемагглютинина (ФГА, 5 мкг/мл). В качестве контроля используют клетки, инкубированные без ФГА;
· за 6-8 час до окончания инкубации в культуру лимфоцитов добавляют тимидин, меченный радиоактивным изотопом 3Н, в концентрации 1 мкКи на лунку;
· по завершении реакции взвесь лимфоцитов переносят на стекловолоконные фильтры, промывают раствором этилового спирта и трихлоруксусной кислоты;
· высушенные в течение ночи фильтры переносят в флаконы со стинтилляционной жидкостью и размещают в конвеере жидкостного β-счетчика для регистрации импульсов излучения, испускаемого 3Н-тимидином, включившимся в массу накопившихся в процессе митотического деления лимфоцитов;
· высчитывают средние арифметические величины числа импульсов в контрольных культурах со средой (спонтанная бласттрансформация) и культурах с ФГА (ФГА-индуцированная лимфопролиферация), определяют индекс стимуляции как отношение числа импульсов в опытных культурах лимфоцитов (стимулированных ФГА) к таковому в контрольных культурах (без ФГА).
15.
· Фагоцитарный индекс;
· фагоцитарное число;
· процент НСТ-позитивных фагоцитов.
16. НСТ-тест.
17.
· Радиоиммунологический анализ;
· иммуноферментный анализ;
· электрохемилюминесцентный метод;
· цепная полимеразная реакция.
18. МКАТ секретируются одним клоном антителообразующих клеток, узко специфичны в отношении отдельной антигенной детерминанты (эпитопа), в то время как поликлональные антитела продуцируются различными клонами антителообразующих клеток в ответ на стимуляцию поликлональными стимуляторами. В организме в обычных условиях в ответ на естественные антигены как правило продуцируются поликлональные антитела.
19. Как отношение числа CD4+-клеток к числу CD8+-клеток (норме 1,5-2,5).
20. Исследование экспрессии Fas-рецептора апоптоза на мононуклеарных клетках, определение уровня каспаз и экспрессии их генов, морфологическое исследование клеток с помощью люминесцентных красителей.
21. CD25.
22.CD71, HLA-DR.
23. ИЛ-1, ИФН-γ, ФНОα, ИЛ-8
24. ИЛ-4, ИЛ-10
25. ИФН-γ, ФНОα
26. CD95
27.
· Использование лазерного проточного цитометра;
· использование люминесцентного микроскопа.
28. «Кластер дифференцировки» (cluster of differentiation) обозначает молекулы, имеющиеся на поверхности клеток, которые могут быть идентифицированы при помощи определенной группы моноклональных антител.
|
|
|
