 |
Рост и размножение микроорганизмов.
|
|
|
|
Ферменты микроорганизмов. Дифференциально-диагностические среды. Бактериологический метод исследования.
Культуральные свойства микроорганизмов. Значение культуральных признаков в определении вида микробов.
К культуральным (или макроморфологическим) свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. На поверхности плотных питательных сред, в зависимости от посева, микроорганизмы могут расти в виде колоний, штриха или сплошного газона.
Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросших из одной клетки (клон клеток). В зависимости от того, где растет микроорганизм (на поверхности плотной питательной среды или в толще ее), различают поверхностные, глубинные и донные колонии.
Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются разнообразием: они видоспецифичны и их изучение используется для определения видовой принадлежности исследуемой культуры.
При описании колоний учитывают следующие признаки (для твёрдых питательных сред):
1.) Размер колоний: 4-6мм – крупные, 2-4мм – средние, 1-2мм – мелкие, меньше 1мм – микроскопические.
2.) Форма колоний: округлые, неровные (неправильные), специфические (львиная грива или цветок маргаритки).
3.) Прозрачность: прозрачные, полупрозрачные, непрозрачные.
4.) Профиль колонии (см. сбоку): плоский, выпуклый, куполообразный, кратерообразный.
5.) Пигмент (окраска в питательной среде).
6.) Консистенция (нужно взять петлю и прикоснуться к среде): мягкая (прогибается), слизистая (тянется), сухая (крошится).
7.) Структура колонии (чашку под микроскоп): зернистая, волокнистая, гомогенная (однородная).
8.) Поверхность: гладкая, шероховатая.
|
|
|
9.) Характер края: ровный, волнистый, фестончатый.
Для жидких питательных сред:
1.) Равномерное помутнение.
2.) Придонно-пристеночный рост (если встряхнуть прозрачную среду, то можно заметить осадок: хлопья, зёрна).
3.) Плёнка (нужно встряхнуть среду): нежная, грубая.
Глубинные колонии чаще всего похожи на более или менее сплющенные чечевички (форма овалов с заостренными концами), иногда комочки ваты с нитевидными выростами в питательную среду. Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом плотной среды, если микроорганизмы выделяют газ.
Донные колонии имеют обычно вид тонких прозрачных пленок, стелющихся по дну.
Особенности колонии могут изменяться с возрастом, они зависят от состава среды и температуры культивирования.
По температурному оптимуму роста выделяют три основные группы микроорганизмов.
1.) Психрофилы - растут при температурах ниже +20 градусов Цельсия.
2.) Мезофилы - растут в диапазоне температур от 20 до 45 градусов (часто оптимум - при 37 градусах С).
3.) Термофилы - растут при температурах выше плюс 45 градусов.
Краткая характеристика питательных сред.
По консистенции выделяют жидкие, плотные (1,5- 3% агара) и полужидкие (0,3- 0,7 % агара) среды.
Агар - полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных (твердых) сред. В качестве универсального источника углерода и азота применяют пептоны - продукты ферментации белков пепсином, различные гидролизаты - мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.
По назначению среды разделяют на ряд групп:
- универсальные (простые), пригодные для различных нетребовательных микроорганизмов (мясопептонный бульон - МПБ, мясопептонный агар - МПА);
- специальные - среды для микроорганизмов, не растущих на универсальных средах (среда Мак - Коя на туляремию, среда Левенштейна - Иенсена для возбудителя туберкулеза);
|
|
|
- дифференциально- диагностические - для дифференциации микроорганизмов по ферментативной активности и культуральным свойствам (среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса);
- селективные (элективные) - для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующих - пептонная вода, селенитовая среда, среда Мюллера.
По происхождению среды делят на естественные, полусинтетические и синтетические.
Рост и размножение микроорганизмов.
3 варианта роста бактерий:
1.) S-форма: крупные, влажные, выпуклые.
2.) R-форма: сухие, шероховатые, неровные края.
3.) M-форма: слизистые, тягучие, есть валик вокруг колонии (приподнятый край).
Бактериальные клетки размножаются в результате деления. Основные стадии размножения микробов в жидкой среде в стационарных условиях:
- лаг-фаза (начальная стадия адаптации с медленным темпом прироста биомассы бактерий);
- экспоненциальная (геометрического роста) фаза с резким ростом численности популяции микроорганизмов (2 в степеии n);
- стационарная фаза (фаза равновесия размножения и гибели микробных клеток);
- стадия гибели - уменьшение численности популяции в связи с уменьшением и отсутствием условий для размножения микроорганизмов (дефицит питательных веществ, изменение рH, rH2, концентрации ионов и других условий культивирования).
Данная динамика характерна для периодических культур с постепенным истощением запаса питательных веществ и накоплением метаболитов.
Если в питательной среде создают условия для поддержания микробной популяции в экспоненциальной фазе - это хемостатные (непрерывные) культуры.
Характер роста бактерий на плотных и жидких питательных средах: сплошной рост, образование колоний, осадок, пленка, помутнение.
Чистая культура - популяция одного вида микроорганизмов.
Основные принципы получения чистых культур: механическое разобщение, рассев, серийные разведения, использование элективных сред, особых условий культивирования (с учетом устойчивости некоторых микробов к определенным температурам, кислотам, щелочам, парциальному давлению кислорода, рН и др.).
В жидких питательных средах при росте микроорганизмов наблюдается помутнение среды, образование пленки или осадка. При росте на полужидких (0,5-0,7 % агара) питательных средах подвижные микробы вызывают выраженное помутнение, неподвижные формы растут только по ходу посева уколом в среду.
Нередко рост микробов сопровождается появлением запаха, пигментацией среды, выделением газа. Характерный запах культур некоторых видов бактерий связан с образованием различных эфиров (уксусноэтилового, уксусноамилового и др.), индола, меркаптана, сероводорода, скатола, аммиака, масляной кислоты.
Способность образовывать пигменты присуща многим видам микроорганизмов. Химическая природа пигментов разнообразна: каротиноиды, антоцианы, меланины. Если пигмент нерастворим в воде, окрашивается только культуральный налет; если же он растворим, окрашивается и питательная среда. Считается, что пигменты защищают бактерии от губительного действия солнечных лучей, поэтому в воздухе так много пигментированных бактерий, кроме того, пигменты участвуют в обмене веществ этих микроорганизмов.
В природе существуют так называемые фосфоресцирующие бактерии, культуры которых светятся в темноте зеленовато-голубоватым или желтоватым светом. Такие бактерии встречаются главным образом в речной или морской воде. К светящимся бактериям - фотобактериям - относятся аэробные бактерии (вибрионы, кокки, палочки).
2. Ферменты бактерий, их классификация и использование в микробиологии и медицине. Ферменты вирулентности.
Микроорганизмы синтезируют различные ферменты - специфические белковые катализаторы. У бактерий обнаружены ферменты 6 основных классов:
|
|
|
1. Оксидоредуктазы - катализируют окислительно - восстановительные реакции.
2. Трансферазы - осуществляют реакции переноса групп атомов.
3. Гидролазы - осуществляют гидролитическое расщепление различных соединений.
4. Лиазы - катализируют реакции отщепления от субстрата химической группы негидролитическим путем с образованием двойной связи или присоединения химической группы к двойным связям.
5. Лигазы или синтетазы - обеспечивают соединение двух молекул, сопряженное с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата.
|
|
|
6. Изомеразы - определяют пространственное расположение групп элементов.
В соответствии с механизмами генетического контроля у бактерий выделяют три группы ферментов:
- конститутивные, синтез которых происходит постоянно;
- индуцибельные, синтез которых индуцируется наличием субстрата;
- репрессибельные, синтез которых подавляется избытком продукта реакции.
Ферменты бактерий делят на экзо- и эндоферменты. Экзоферменты выделяются во внешнюю среду, осуществляют процессы расщепления высокомолекулярных органических соединений. Способность к образованию экзоферментов во многом определяет инвазивность бактерий - способность проникать через слизистые, соединительнотканные и другие тканевые барьеры.
Примеры:гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав межклеточного вещества, что повышает проницаемость тканей (клостридии, стрептококки, стафилококки и многие другие микроорганизмы); нейраминидаза облегчает преодоление слоя слизи, проникновение внутрь клеток и распространение в межклеточном пространстве (холерный вибрион, дифтерийная палочка, вирус гриппа и многие другие). К этой же группе относятся энзимы, разлагающие антибиотики.
В бактериологии для дифференциации микроорганизмов по биохимическим свойствам основное значение часто имеют конечные продукты и результаты действия ферментов. В соответствии с этим существует микробиологическая (рабочая) классификация ферментов: сахаролитические, протеолитические, аутолитические, окислительно-восстановительные, ферменты патогенности (вирулентности).
Ферментный состав клетки определяется геномом и является достаточно постоянным признаком. Знание биохимических свойств микроорганизмов позволяет идентифицировать их по набору ферментов. Основные продукты ферментирования углеводов и белков - кислота, газ, индол, сероводород, хотя реальный спектр для различных микроорганизмов намного более обширный.
Основные ферменты вирулентности - гиалуронидаза, плазмокоагулаза, лецитиназа, нейраминидаза, ДНК-аза. Определение ферментов патогенности имеет значение при идентификации ряда микроорганизмов и выявления их роли в патологии.
Ряд ферментов микроорганизмов широко используется в медицине и биологии для получения различных веществ (аутолитические, протеолитические), в генной инженерии (рестриктазы, лигазы).
|
|
|
