 |
Использование культуры растительных тканей для получения стероидных соединений.
|
|
|
|
На основе культур растительных тканей было выделено более 50 различных стероидных соединений: b-ситостерин, стигмастерин, диосгенин, холестерин, тигогенин, гитогенин, 24-метиленхолестерин и другие.
Виды диоскореи интенсивно изучаются в культуре ткани в качестве возможных продуцентов стероидных сапонинов. Диосгенин, представляющий интерес в качестве исходного вещества для производства гормональных препаратов, выделен из культур тканей видов Dioscorea, D. deltoidea, D. tokoro, D. composita, D. floribunda, Solanum xanthocarpum, S. laciniatum и другие. Содержание диосгенина в культурах тканей в зависимости от происхождения и условий культивирования растений различно: 1,33 % в культурах клубневого происхождения D. floribunda; 3,8 % в культуре ткани D. Deltoidea, росшей в хемостате.
В настоящее время наметился переход к промышленным способам культивирования тканей D. Deltoidea. Скорость роста культуры D. deltoidea в ферментере достигла 0,55 г/л в день, максимальная продуктивность по содержанию диосгенина – 12 мг на 1 л культуральной среды за один день в случае двухстадийного процесса (7,8 % от массы сухой ткани).
В сумме сапонины, выделенные из каллусных тканей D. deltoidea, обладали фармакологической активностью, аналогичной активности стероидных сапонинов из интактного растения.
Работы ученых с культурами тканей, продуцирующими стероидные соединения, внесли большой вклад в изучение биосинтеза этих соединений. Используя меченые предшественники (14С-ацетат, 14С-мевалоновую кислоту, 14С-2,3-оксидосквален, 4-14С-холестерин и другие соединения) было установлено, что ключевым предшественником сапонинов является циклоартенол, а также то, что гидроксилированию кольца А в биосинтезе йоногенина и токорогенина предшествует гидроксилирование боковой цепочки холестерина.
|
|
|
В результате комплекса таких исследований предложена следующая последовательность биосинтеза стероидных сапонинов: мевалонат–циклоартенол–холестерин–3, 16, 26–тригидроксихолест–5–ен–3, 16, 22, 26–тетрагидроксихолест–5–ен–диосгенин (йоногенин) – токорогенин.
Задание 2. Выполнить лабораторную работу.
Вариант 1. Биотрансформация лекарственных веществ в организме.
1. Качественная реакция на дезоксикортикостерон-ацетат (лекарственный препарат).
Принцип метода. Реакция основана на взаимодействии дезокортикостерон-ацетата с серной кислотой с образованием продукта с образованием продукта синего цвета с красной флюоресценцией.
Техника выполнения работы. К 1 капле дезоксикортикостерон-ацетата добавить 4 – 5 капель 96 % спирта и 4 – 5 капель раствора концентрированной серной кислоты. Нагреть до закипания. Появляется синее окрашивание.
2. Обнаружение 17-кетостероидов в моче (продуктов окисления стероидных гормонов).
Принцип метода. Метод основан на взаимодействии 17-кортикостероидов с м-динитробензолом в щелочной среде с образованием продуктов конденсации розово-фиолетового цвета.
Техника выполнения работы. К 4 – 5 каплям мочи добавить 4 – 5 капель 2 % раствора м-динитробензола в спирте и 2 – 3 капли концентрированного раствора гидроксида калия. Появляется розово-фиолетовое окрашивание.
Вариант 2. Биотрансформация органических субстратов ферментативными системами культивируемых тканей растений.
Целью проводимого исследования является:
1. Ознакомление с основными типами реакций биотрансформации, катализируемых монооксигеназными системами животных, растительных и микробных клеток.
2. Освоение метода определения n-анилингидроксилазной активности культуры ткани женьшеня.
Принцип метода. Метод определения n-анилингидроксилазной активности основан на определении образующегося n-аминофенола. Реакция протекает на молекуле цитохрома Р-450 только в присутствии молекулярного кислорода и НАДФ×Н+, являющихся необходимыми кофакторами процесса микросомального окисления.
|
|
|
n-аминофенол реагирует с фенолом и в присутствии карбоната натрия образует окрашенный в синий цвет индофенольный комплекс.
Практическая значимость работы.
1. На примере n-гидроксилирования анилина показано, что культуры тканей растений могут быть использованы не только в биосинтезе вторичных метаболитов de novo, но и для биотрансформации химических соединений.
2. Способность культивируемых тканей растений может быть использована в биотехнологических синтезах фармацевтических препаратов (стероидов, алкалоидов, гликозидов и других).
3. Путем селекции или с помощью методов генетической инженерии можно создавать линии клеток с более высокой трансформирующей способностью.
Техника выполнения работы. Навеску ткани (1,0 г) тщательно растирают в ступке с 1 мл буфера с целью гомогенизации. Гомогенат центрифугируют при 15000 об/мин. Надосадочная жидкость представляет собой экстракт ткани, свободный от митохондрий, ядер и обломков клеток.
Схема проведения опыта.
| Вариант | Состав инкубационной смеси, мл | ||||
| 0,04 М трис-HCl буфер, рН 7,4 | 0,16 М MgCl2 | 0,03 М НАДФ×Н+ | Экстракт культуры ткани | 0,03 М анилин | |
| Опыт | 1,5 | 0,1 | 0,1 | 0,2 | 0,1 |
| Контроль | 1,6 | 0,1 | 0,2 | 0,1 |
Инкубацию проводят при 37 °С в течение 15 минут. Реакцию останавливают добавлением 1 мл 10 % раствора ТХУ. После осаждения белков смесь фильтруют, отбирают 1 мл фильтрата и определяют содержание в нем n-аминофенола путем добавления 0,5 мл 10 % раствора карбоната натрия и 1,5 мл 2 % фенола в 0,2 М растворе гидроксида натрия. Для развития окраски пробы выдерживают на водяной бане при 37 °С в течение 10 минут. Оптическую плотность опытной пробы против контрольной измеряют на фотоэлектроколориметре в кювете 10 мм при 670 нм.
Величину n-анилингидроксилазной активности рассчитывают по формуле:
С*1,5*30,
г ткани
где С – концентрация n-аминофенола, найденная по калибровочному графику;
1,5 – расчетный коэффициент численно равный объему экстракта, полученному из 1,0 г ткани;
|
|
|
30 – разведение пробы.
Литература:
1. Биологическая химия: Руководство к лабораторным занятиям/ Сост. В.П. Комов, В.Н. Шведова, Н.В. Кириллова, О.М. Спасенкова, В.И. Фирсова, Л.А. Троицкая. – СПб.: СПХФА. – 1998.
2. Биотехнология в 8-ми томах/ Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. – М.: Высш.шк. – 1988.
3. Биотехнология: принципы и применения/ Под ред. Хиггинса И., Беста Д., Джонса Дж. – М.: Мир. – 1988.
4. К практическим занятиям по биологической химии: Методические указания/ Под ред. В.И. Закревского. – Волгоград: ВМА. – 1999.
5. Лекционный материал по биотехнологии.
6. Микробиология продуцентов биологически активных соединений: Методические указания к лабораторным занятиям/ Сост. С.В. Гурина, Т.С. Потехина, Н.Н. Елинова. – СПб.: СПХФА. – 1997.
7. Николаева Л.А. Культура тканей лекарственных растений и ее биотехнологическое использование: Текст лекций. – СПб.: СПХФИ. – 1992.
8. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды/ Пер. с англ. Мехедова С.Л., Миркина С.М. – М.: Мир. – 1987.
9. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб./ Под ред. В.С. Шевелухи. – М.: Высш. шк. – 1988. – 416 с.
10. Словарь по биотехнологии/ Симонян А.В., Покровская Ю.С. – Волгоград. – 2002.
Темы рефератов.
1. Проблемы биотрансформации стероидных структур.
2. Структура промышленного биотехнологического производства стероидных гормонов.
3. Подходы к решению проблемы селективности процессов биоконверсии.
4. Микробиологический синтез гидрокортизона.
5. Получение стероидных соединений на основе культур растительных клеток.
6. Перспективы осуществления процессов биоконверсии стероидных соединений с применением технологии иммобилизованных ферментов.
Занятие 15.
Микробиологическая трансформация стероидных соединений.
Вариант 1.
1. Выделение и очистка продуктов биологического синтеза и органического синтеза имеет принципиальные отличия на стадиях процесса:
а) всех;
б) конечных;
в) первых;
г) принципиальных различий нет.
2. Основное преимущество ферментативной биоконверсии стероидов перед химической трансформации состоит:
|
|
|
а) в доступности реагентов;
б) в избирательности воздействия на определенные функциональные группы стероидов;
в) в сокращении времени процесса;
г) в получении принципиально новых соединений.
3. Увеличение выхода целевого продукта при биотрансформации стероида достигается:
а) при увеличении интенсивности перемешивания;
б) при увеличении интенсивности аэрации;
в) при повышении температуры ферментации;
г) при исключении возможности микробной контаминации;
д) при увеличении концентрации стероидного субстрата в ферментационной среде;
е) при целенаправленном изменении химической структуры стероидного субстрата.
4. Ослабление ограничений на использование в промышленности микроорганизмов-рекомбинантов, продуцирующих гормоны человека, стало возможным благодаря:
а) совершенствованию методов изоляции генно-инженерных рекомбинантов от окружающей среды;
б) повышению квалификации персонала, работающего с рекомбинантами;
в) установленной экспериментально слабой жизнеспособности рекомбинанта;
г) экспериментальному подтверждению обязательной потери чужеродных генов.
5. Регулируемая ферментация в процессе биосинтеза достигается при способе:
а) периодическом;
б) непрерывном;
в) отъемно-доливном;
г) полупериодическом.
|
|
|
