Осаждение белков при нагревании.

Молекулярная масса белков.

 

Белки относятся к высокомолекулярным соединениям, в состав которых входят сотни и тысячи аминокислот, поэтому они имеют большие значения молекулярной массы (от 6 000 до 1 000 000 и выше). Для определения молекулярной массы используют различные физико-химические методы: седиментационный, осмометрический, гель-фильтрационный, вискозометрический, ультрафильтрационный, электрофоретический, оптический.

Оптические свойства.

 

Белки являются оптически активными веществами, так как состоят из оптически активных аминокислот. Они способны вращать плоскость поляризации света, рассеивать световые лучи видимой части спектра и поглощать ультрафиолетовые лучи. Эти свойства используют при количественном определении белков, определении их конформации, молекулярной массы.

 

3.Белки способны адсорбировать на своей поверхности низкомолекулярные органические соединения и ионы (витамины, ионы железа, меди и др.), а иногда и захватывать их внутрь молекулы. С этим свойством белков связана их транспортная функция в организме.

 

Амфотерность белков.

 

Белки, также как и аминокислоты, являются амфотерными электролитами благодаря одновременному присутствию -СООН и –NH2 групп. Диссоциация этих групп приводит к заряжению белковой молекулы. В зависимости от преобладания в молекуле белка моноаминодикарбоновых (глутаминовой, аспарагиновой) или диаминомонокарбоновых аминокислот (лизина, аргинина) белки в водных растворах обладают свойствами слабых кислот или слабых оснований, соответственно. Большинство природных белков имеют кислый характер (казеин, желатина, альбумины и др.) и в водном растворе несут отрицательный заряд, основные белки (гистоны, протамины) в водном растворе заряжены положительно. Свойство амфотерности лежит в основе буферных свойств белков и их участии в регуляции рН крови.

 

Подвижность в электрическом поле.

 

В связи с тем, что белки являются заряженными частицами, они двигаются в электрическом поле к катоду или аноду в зависимости от величины их суммарного заряда. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от величины рН среды.

Изменяя значение рН среды, можно добиться такого состояния, когда количество положительно и отрицательно заряженных групп будет одинаково, заряд белка при этом равен нулю, и молекула белка не будет перемещаться в электрическом поле. Такое значение рН среды определяется как изоэлектрическая точка (рНИЭТ). Значение изоэлектрической точки зависит от аминокислотного состава и специфично для каждого белка, например, для казеина рНИЭТ = 4,7, для яичного альбумина – 4,8, яичного глобулина – 6,6, желатина – 4,9, зеина (кукурузного белка) – 6,2. Чем дальше будет отстоять значение рН среды от рНИЭТ, тем большим суммарным зарядом будут обладать молекулы белка и с большей скоростью двигаться в электрическом поле.

 

Это свойство положено в основу электрофоретического метода, используемого для идентификации и фракционирования белков, а также при исследовании физико-химических свойств белков.

 

Растворимость белков.

 

Белки сильно различаются по своей растворимости в водных системах. При растворении белков в воде вокруг их молекул образуется гидратная оболочка, которая наряду с зарядом белковых частиц является фактором устойчивости белковых растворов.

 

На растворимость белков существенное влияние оказывают следующие факторы: а) рН, б) ионная сила, в) диэлектрические свойства растворителя и г) температура.

 

а) Влияние рН раствора на растворимость белков.

 

При значении рН раствора, совпадающем с величиной рНИЭТ, белки будут обладают наименьшей растворимостью. Объясняется это тем, что в изоэлектрической точке суммарный заряд молекулы белка равен нулю, и, следовательно, между соседними молекулами белка отсутствует электростатическое отталкивание. При значениях рН, отличных от значений рНИЭТ, молекулы белка имеют суммарный заряд одного знака, вследствие чего они отталкиваются друг от друга. На этом свойстве основан метод изоэлектрического осаждения белков.

 

б) Влияние ионной силы на растворимость белков.(

 

При добавлении к растворам белка солей небольших концентраций растворимость многих белков повышается. Этот эффект зависит также от величины зарядов каждого из ионов, присутствующих в растворе: соли, содержащие двухзарядные ионы значительно эффективнее повышают растворимость белков, чем соли, содержащие однозарядные ионы.

 

При значительном повышении концентрации солей растворимость белков начинает опять понижаться, и при очень высоких концентрациях соли белок может полностью выпасть в осадок (если рН среды совпадает с рНИЭТ). Это явление называется высаливанием.

 

Оба описанных эффекта, т.е. повышение растворимости белков при низких концентрациях соли и понижение при высоких концентрациях, широко используются для разделения белковых фракций, очистки белков, получения их в кристаллическом виде.

 

в) Влияние растворителя на растворимость белков.

 

Добавление смешивающихся с водой нейтральных органических растворителей уменьшает растворимость большинства белков в воде до такой степени, что они могут выпадать в осадок (если при этом рН раствора совпадает с рНИЭТ). Например, этанол или ацетон, являясь водоотнимающими веществами, понижают степень гидратации белков и уменьшают их растворимость.

Кроме того, растворимость белков зависит от диэлектрической постоянной среды (при постоянных значениях рН и ионной силы). С уменьшением диэлектрической постоянной растворителя силы притяжения между двумя молекулами белка возрастают, что способствует агрегации белков, т.е. снижает их растворимость. Эти закономерности используют для разделения белковых молекул.

 

г) Влияние температуры на растворимость белков.

 

В сравнительно узком интервале температур, приблизительно от 0 до 40°С, растворимость большинства белков возрастает с повышением температуры. При температурах, превышающих 40—50°С, большинство белков утрачивает стабильность, начинается их денатурация, сопровождающаяся обычно резким снижением растворимости.

 

 

Денатурация белков.

 

В настоящее время установлено, что для каждого белка характерна только одна пространственная структура, в которой он стабилен и проявляет биологическую активность. Эта структура носит название нативной конформации белка. ДЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКА.... ДЕНАТУРАЦИЯ - это лишение белка его природных, нативных свойств, сопровождающееся разрушением четвертичной (если она была), третичной, а иногда и...Изменение нативной конформации белка, сопровождающееся потерей характерных для него свойств: растворимости, биологической активности, электрофоретической подвижности и др., называется денатурацией. Денатурация, как правило, затрагивает четвертичную, третичную и частично вторичную структуры белковой молекулы и не сопровождается какими-либо изменениями первичной структуры.

Примером тепловой денатурации может служить «свертывание» белка при варке яиц. Денатурация белков происходит в желудке, где имеется сильнокислая среда и это способствует расщеплению белков протеолитическими ферментами. По мере старения организма происходит постепенная, хотя и чрезвычайно медленная, денатурация белков и снижение их гидрофильности.

 

При определенных условиях денатурированный белок можно частично или полностью вернуть к исходному нативному состоянию. Такой процесс называют ренатурацией, а белок – ренатурированным. Этот процесс происходит самопроизвольно при значениях рН и температуры, обеспечивающих стабильность нативной формы, и не требует подвода энергии извне. Ренатурацию обычно проводят в мягких условиях, медленно снимая воздействие.

 

 

 

Большинство белков относятся к высокомолекулярным соединениям, которые хорошо растворяются в воде. Растворение белков в воде связано с гидратацией его молекул и образованием вокруг частиц белка гидратной оболочки.

 

Любые физические и химические факторы, нарушающие гидратацию молекул белка и нейтрализующие их заряд, приводят к понижению растворимости белка и способствуют выпадению его в осадок.

 

Осаждение белков при нагревании.

 

Воздействие высокой температуры ведет к тепловой денатурации белков, в результате которой нарушается вторичная, третичная и четвертичная структуры белка. Свертывание большинства белков начинается при температуре 50-550С. При кратковременном нагревании денатурация может и не произойти или проявится в слабой степени, дальнейшее же повышение температуры ведет к быстрому свертыванию белка.

 

На скорость и интенсивность процесса тепловой денатурации оказывают большое влияние рН раствора и присутствие электролитов. Быстро и наиболее полно белки свертываются в изоэлектрической точке. В сильно кислых и в сильно щелочных растворах осаждение белков при кипячении практически не происходит, так как молекулы белка приобретают положительный или отрицательный заряды соответственно.

 

Реактивы: водный раствор яичного белка, 1 и 10%-ные растворы уксусной кислоты, 10%-ный раствор гидроксида натрия, насыщенный раствор хлорида натрия.

 

Выполнение работы. В пять пробирок наливают по 1 мл раствора белка. Белок в первой пробирке нагревают до кипения, при этом раствор мутнеет, но осадок не выпадает.

 

К раствору белка во второй пробирке добавляют одну каплю 1%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают, при этом выпадает хлопьевидный осадок белка.

 

К раствору белка в третьей пробирке прибавляют 5 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения, при этом осадок не образуется.

 

В четвертую пробирку прибавляют 5 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и 6 капель насыщенного раствора хлорида натрия, нагревают до кипения - белок выпадает в осадок.

 

В пятую пробирку добавляют 5 капель 10%-ного раствора гидроксида натрия и нагревают до кипения, при этом осадок не выпадает.

 

Объяснить наблюдаемые явления, если известно, что в состав яичного белка входят: яичный альбумин с рНИЭТ = 4,8 и яичный глобулин с рНИЭТ = 6,6.

 

 

2. Осаждение белков органическими растворителями.

 

Органические растворители (спирт, эфир, ацетон и др.) разрушают гидратную оболочку белка, что приводит к понижению его устойчивости и выпадению белка в осадок.

 

Осаждение белков этанолом обратимо при кратковременном воздействии реагента и без нагревания. Длительный контакт белка со спиртом приводит к необратимой денатурации.

 

Реактивы: раствор яичного белка, этиловый спирт, ацетон.

 

Выполнение работы. К 1 мл раствора белка прибавляют 2 мл этилового спирта и взбалтывают. Выпадает осадок белка, который вновь растворяется при разбавлении водой.

 

К 1 мл того же раствора белка прибавляют 2 мл ацетона и энергично встряхивают. Раствор белка мутнеет.

 

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: