 |
Сортовые качества посадок семенного картофеля
|
|
|
|
| № п/п | Наименование показателя | Норма для питомников | ||
| ОС | ОЭ | РС | ||
| Сортовая частота посадок, % не менее | 98,5 | |||
| 2. | Наличие растений растений, пораженных болезнями по внешним признакам, % (по счету не более) в т.ч. -легкими вирусными болезнями; -тяжелыми вирусными болезнями; - почвенными вирусами; - вироидными -бактериями | 0,4 0,4 Не допускается --«-- --«-- --«-- | 4,0 3,0 1,0 Не допускается --«-- --«-- | 10,0 без ограничений 10,0 Не допускается --«-- 2,0 |
Задания для самостоятельной работы.
1. Изучить особенности проведения апробации на сортовых посадках картофеля.
Идентификация сортов пшеницы и ячменя методом электрофореза.
Для определения подлинности и сортовой чистоты семян помимо полевой апробации проводят лабораторный анализ по морфологическим признакам растения, зерна и проростков. Число таких признаков ограничено, к тому же они подвержены изменениям под влиянием условий выращивания.
Поэтому наиболее надежный и удобный лабораторный метод сортового контроля – идентификация сортов по электрофоретическому спектру запасных белков – проламинов у злаков и глобулинов у двудольных культур.
Проламины – многокомпонентные запасные белки злаков. Они локализованы в эндосперме и составляют до 75 % его белка. Среди проламинов злаков наиболее изучены глиадины и секалины пшеницы и ржи.
Электрофоретический метод применяется при установлении оригинальности и генетической однородности сорта в государственном сортоиспытании и определении типичности и генетической однородности при отборе лучших растений в семеноводстве. Метод является одним из наиболее перспективных для распознавания видовых и сортовых примесей, не отличающихся по морфологическим признакам, в семенном контроле.
|
|
|
При использовании идентификации сортов по элетрофоретическим спектрам запасных белков появляется возможность исключить гетерозиготные растения на первых этапах семеноводства, поскольку в питомниках отбора и испытания потомств ведется контроль за присутствием необычных типов растений и колосьев. В случае наличия различий по белковому спектру внутри колоса или растения делается вывод, что этот тип возник благодаря естественному переопылению и, следовательно, нежелателен.
Эта информация важна для подготовки рекомендаций по допустимому уровню отклоняющихся типов при апробации семенных посевов новых сортов. Такие рекомендации позволяют более эффективно провести выбраковку семей в питомниках испытания и уменьшить число фитосортопрочисток в питомниках размножения.
Существуют два различных способа электрофоретического разделения проламинов: электрофорез нативного проламина в лактактном или ацетатном буфере в присутствии мочевины (pН 3.1-3.2) и электрофорез проламина, денатурированного и восстановленного (по внутримолекулярным S-S связям) в присутствии ДДС и в - β меркаптоэтанола в трис-боратном буфере (pН 8,5). Для краткости этот способ называют ДДС – электрофорезом.
Для сортовой идентификации обычно используют электрофорез нативного проламина в кислом буфере или изоэлектрофокусирование в соотвествующих интервалах ph.
Существует несколько модификаций электрофореза проламина в кислом буфере – дисковый и в пластинах (вертикальных и горизонтальных) на крахмальном и полиакриламидном гелях. Разработан стандартный арбитражный метод электрофореза проламина пшеницы и ячменя, включенный в Международные Правила анализа семян.
Электрофоретический метод – метод разделения веществ (проламинов) по подвижности в электрофоретическом поле. Проламины экстрагируются из семян и разделяются в полиакриламидном геле (ПААГ) в кислой среде.
|
|
|
Электрофоретические спектры проламина специфичны не только для сорта, но и для отдельных линий внутри сорта. Большинство сортов имеет уникальные спектры, но есть сорта с близкими или одинаковыми по компонентному составу спектрами. В основном это сорта, полученные отбором из одной и той же гибридной популяции.
При определении подлинности семян по электрофоретическим спектрам проламина необходимо иметь спектры или все типы спектров проламина, характерные для анализируемых сортов пшеницы и ячменя в виде каталогов фотографий спектров проламина и их формул. Каталоги составляют на основе анализа семян, полученных от оригинатора в период районирования сорта. Сопоставляя со спектрами каталога спектры проламинов анализируемых сортов, устанавливают их подлинность и чистоту.
Отбор проб.
Идентификация сортов электрофоретическим методом проводится анализом единичных зерен с растений или в случайной выборке из партии семян (100 шт). Очень точное определение сортовой чистоты или детальный анализ на биотипный состав сложного сорта могут потребовать последовательный анализ 2-3-х выборок. Для простого определения идентичности партий семян или оценки образца на сортовую принадлежность достаточна выборка из 50 семян и меньше.
Стандартный арбитражный метод ISTA для идентификации сортов пшеницы и ячменя электрофорезом в полиакриламидном геле.
Приборы и оборудование. Электрофоретический прибор GE 2/4 фирмы «Фармация» и источник питания EPS 400/500. Можно использовать и любую другую вертикальную электрофоретическую систему.
Реактивы. Акриламид и бисакриламид (специально очищенные для электрофореза), мочевина, ледяная уксусная кислота, глицин, сульфат железа, аскорбиновая кислота, перекись водорода, монотиоглицерол, пиронин G, трихлоруксусная кислота, этанол, 2-хлорэтанол, Кумасси голубой G-250 или R- 250.
Растворы.
1) Экстрагирующий раствор – для глиадина пшеницы: 25 % 2-хлорэтанол, хранить на холоде. Для гордеина ячменя: 20 % 2-хлорэтанол, содержащий 18 % мочевину и 1 % монотиоглицерол (или 2-меркаптоэтанол), хранить на холоде или готовить свежий.
|
|
|
К экстрагирующим растворам может быть добавлен 0,05 % пиронин G (или метиловый зеленый) в качестве метчика.
2) Буферный раствор для сосудов: ледяная уксусная кислота (4 мл) и глицин (0, 4 г) на 1 л воды (рН 3,2), хранить на холоде.
3) Буферный раствор для геля: ледяная уксусная кислота (20 мл) и глицин (1,0 г) на 1 л воды, хранить на холоде.
4).Окрашивающий раствор: 10 %-ная трихлоруксусная кислота, 1 % спиртовой раствор Кумасси голубого.
Выделение проламина. Отдельные семена размельчают плоскогубцами и переносят в 1,5 мл полипропиленовые центрифужные пробирки. Добавляют экстрагирующий раствор (0,2 мл для пшеницы и 0, 3 мл для ячменя), содержимое пробирок тщательно перемешивают и оставляют на ночь при комнатной температуре. Пробирки центрифугируют. Надосадочную жидкость используют для электрофореза.
Приготовление геля. Чистые и сухие кассеты для геля собирают в соответствии с инструкцией к прибору. Если снятие геля со стеклянных пластин будет затруднено, то их можно обработать силиконом. Чтобы приготовить 100 мл гелевой среды, берут около 60 мл буферного раствора для геля и последовательно добавляют 10 г акриламида, 0, 4 г бисакриламида, 6 г мочевины, 0,1 г аскорбиновой кислоты, 0,005 г сульфата железа. Раствор перемешивают и доводят до 100 мл буферным раствором для геля. Затем добавляют свежеприготовленный 0,6 % р-р перекиси водорода (0,35 мл на 100 мл гелевой среды), быстро смешивают и заливают в кассеты. Перед добавлением перекиси гелевую смесь можно охладить (ближе к замерзанию). Для получения карманов в геле помещают в кассету акриловую гребенку. Гелевая смесь должна наполнять кассету доверху. Полимеризация идет 5-10 мин.
Вместо перекиси водорода можно использовать персульфат аммония (0,1 мл свежеприготовленного 10 % раствора) и ТЕМЕД (0,3 мл), которые добавляются к гелевой смеси перед заливкой в кассеты.
Проведение электрофореза. Акриловую гребенку удаляют из геля, и полученные карманы промывают буферным раствором для сосудов. Сосуды заполняют необходимым объемом буфера (в зависимости от используемого прибора). Образцы по 10-20 мкл вносят в карманы, и гель помещают в сосуд. Электрофорез проводят при 500 В (постоянное напряжение). Для разделения белков требуется времени вдвое больше, чем для удаления пиронина G с геля, или втрое большее, чем для удаления метилового зеленого. Буферные сосуды охлаждаются до 15-200 С проточной водой.
|
|
|
Фиксация и окрашивание. Кассеты с гелем удаляют из сосуда, открывают, и гели переносят в пластиковые коробки, содержащие 5-10 мл 1% Кумасси G-250 (или R-250) в 200 мл 10 % трихлоруксусной кислоты. Окрашивание заканчивается через 1-2 дня. Отмывание от избытка красителя не требуется. Осевшую краску можно снять с поверхности геля кисточкой. Для усиления окраски гели промывают в воде. Затем гели просматривают и фотографируют. Голубой фон удалают путем промывания в 10 % трихлоруксусной кислоте. Гели можно хранить в полиэтиленовых пакетах при 40 С много месяцев без измененийэлектрофоретических спектров.
Номенклатура глиадиновых и гордеиновых линий. Глиадиновые и гордеиновые компоненты могут быть идентифицированы путем измерения их относительной подвижности, составления белковых формул или описания спектров.
Специфичный электрофоретический спектр запасных белков в ряде случаев, когда селекционные линии с новыми ценными свойствами не отличаются от исходных по морфологическим признакам, является единственным отличительным признаком нового сорта. И только по этому признаку может осуществляться контроль подлинности и сортовой чистоты такого сорта.
Для новых сортов сельскохозяйственных культур составлены каталоги белковых формул, которые характеризуют их оригинальность, биотипный состав, селекционную ценность по качеству зерна.
Пример. Методом электрофореза был установлен сложный генетический состав сортов озимой пшеницы белорусской селекции.
В целом весь спектр глиадина (табл.12) можно дифференцировать на часто и редко встречающейся позиции четырех фракций – α,β,γ и w, к числу общих позиций спектра для всех анализируемых сортов следует отнести α 67, β2345, γ 23 и w24689. Встречаемость этих вариантов у всех образцов достаточно высокая. Однако наряду с общими компонентами выявляются редкие по отдельным зонам спектра – α 3, γ 1.5, w 3. Компонентом α 3 представлен сорт Копылянка. Позиция γ 1 встречается только у Гармонии второй биотипной группы. Компонент γ 5 имеется у двух первых сортов – Березина и Надзея, а также у Гармонии. Компонент w 3 оказался характерным только для второй биотипной группы сорта Гармония.
Встречаемость двух редких позиций w 3 и γ 1 в одном биотипе может говорить о его ценности. Содержание спектрального состава по биотипам других сортов отличается либо интенсивностью компонентов, либо наличием совершенно нового сочетания позиций.
|
|
|
Как видно из табл.12, в спектре зон α,w у Березины, Пошука и Копылянки биотипные группы значительно различаются по позициям двух фракций – α 2345 и w 57. Для биотипов Надзея, Сузорье возможные отличия будут обнаруживаться только по α - зоне спектра, в позициях либо α 245, либо α 34. Наиболее отчетливое число разных компонентов было установлено между биотипами Гармонии. Здесь эти различия просматриваются по компонентам α –5, γ 1,5 и w 3 – зонам спектра. Такие отличительные особенности электрофореграмм свидетельствуют о существенном различии биотипных групп этого сорта.
Таблица 12
|
|
|
