 |
Конфигурация «Cell-attached»
|
|
|
|
Только что описанная конфигурация называется cell-attached patch-clamp (patch-clamp «на клетке»).
Эта конфигурация, однако, имеет два неудобства.
Во-первых, она не позволяет с достаточной надежностью измерять, а следовательно, и задавать трансмембранную разность потенциалов — поскольку оба электрода — как пипеточный, так и внешний, находятся по одну сторону мембраны. Вообще говоря, можно, используя омывающий раствор с ионной композицией, повторяющей состав цитоплазмы, деполяризовать мембрану вне пипетки, так что разность потенциалов между внешним электродом и цитоплазмой исчезнет, а тогда разность потенциалов между электродами окажется равна трансмембранному потенциалу — но все это весьма приблизительно, так как точный состав цитоплазмы нам неизвестен.
Во-вторых, эта конфигурация не позволяет контролировать состав среды вне пипетки — там остается цитоплазма, состав которой не вполне определен.
В силу этих причин cell-attached mode применяется довольно ограниченно.
Конфигурация Inside-out
Однако, если пипетку быстрым движением отвести от клетки, то «внутренний» кусочек мембраныоторвется от клетки и получится конфигурация inside-out (наружная сторона внутри), названная так потому что внутренняя, обычно обращенная к цитоплазме, сторона мембраны окажется снаружи — в омывающем растворе, а наружная — внутри пипетки. Альтернативный метод перехода в конфигурацию inside-out заключается в следующем: из конфигурации cell-attached пипетку отводят плавно, формируя с двух сторон закрытую везикулу; затем поднимают пипетку в воздух и опускают во вторую ванночку, с внутриклеточным раствором. При переносе внешняя мембрана везикулы разрушается, в результате формируется конфигурация inside-out.
|
|
|
Теперь разность потенциалов на фрагменте мембраны строго равна разности потенциалов между электродами. Очевидно, что при использовании такой модификации пипетку заполняют раствором, имитирующим внеклеточную среду, тогда как омывающий раствор делают близким по составу к цитоплазме. При этом, меняя состав омывающего раствора, можно изучать, как такие изменения в цитоплазме влияют на ток интересующих нас каналов —ведь омывающий раствор контактирует с цитоплазматической стороной мембраны).При этом мы точно знаем как состав жидкости по обе стороны мембраны, так и разности потенциалов, что позволяет достаточно точно характеризовать каналы, используя уравнения Нернста и Гольдмана-Ходжкина-Каца, так что на этом уровне электрофизиология превращается в биофизику каналов. при этом, если в изолированный участок мембраны попал один канал, то мы наблюдаем поведение единичной молекулы и, если это лиганд-регулируемый канал-рецептор, то ее взаимодействие с другими единичными молекулами.
Конфигурация Whole-cell
Если по условиям эксперимента необходимо менять состав внеклеточной среды, можно использовать конфигурацию whole cell («»). В этом случае пипетку не отводят от клетки, а подают в нее отрицательное давление и таким образом разрушают изолированный фрагментмембраны.
После этого пипетка соединена с внутриклеточной средой; поскольку клетка обычно маленькая, то, благодаря диффузии, состав цитоплазмы вскоре оказывается идентичным составу пипеточного раствора, поэтому мы, как и в предыдущем случае, знаем как состав жидкостей, так и разность потенциалов. Отметим, что если в конфигурации inside-out пипеточный электрод был внеклеточным, а внутренний — внутриклеточным, то теперь их роли изменились, так что задавая потенциал, необходимо инвертировать полярность. Преимущество этого метода состоит и в том, что здесь оказываются сохранны все клеточные структуры и регуляторные механизмы. Но есть и недостаток — мы измеряем суммарный ток всех каналов в клетке, между тем одно из главных достоинств patch-clamp состоит в возможности изучения отдельных молекул.
|
|
|
Конфигурация Outside-out
Решить эту проблему позволяет конфигурация outside-out (наружная сторона снаружи). Если после перехода в whole-cell mode медленно отводить пипетку от клетки, мембрана не отрывается сразу, а начинает вытягиваться в трубку
Обратите внимание — в пипетке отчетливо видны кусочки цитоплазмы, попавшие туда после разрушения мембраны при переходе в whole-cell.
Следующая фаза процесса представлена на фото 6.
Мембранная трубка стала совсем тонкой и почти невидима («протуберанец» у поверхности клетки — это небольшая часть цитоплазмы, оставшаяся в мембранной трубке). В следующее мгновение трубка порвется, а мембрана сомкнется на пипетке в «вывернутом» виде — мы окажемся в конфигурации «outside-out»
Итак, пипетка и ее электрод — подобно конфигурации whole-cell — внутриклеточные, мы свободно меняем состав внеклеточного раствора, площадь исследуемой мембраны невелика, так что мы вновь можем изучать одиночные каналы.
Perforated patch
Perforated patch («продырявленный patch»)— это специфический вариант patch-clamp в whole-cell mode. В данном случае, после формирования гигаомного контакта в пипетку подаётся новый раствор, содержащий небольшое количество специального антибиотика, например Амфоторецина-В либо Грамицидина. Антибиотики этого класса образуют отверстия в клеточной мембране на участке, присоединенном к электроду.
Такой подход позволяет избежать замещения внутренней среды клетки раствором из пипетки-электрода, то есть клетка остаётся живой с минимальными, насколько это возможно, повреждениями. Таким образом, ответы клетки на раздражители являются максимально приближёнными к естественным. В то же время, данному методу присущ ряд едостатков. Во-первых, по сравнению с классическим whole-cell mode, электрическое сопротивление доступа (которое состоит из сопротивления пипетки и сопротивления в месте соединения пипетки с мембраной) является значительно более высоким. Это понижает уровень распознавания электрического тока, повышает уровень шума при записи, и экспоненциально увеличивает значения всех ошибок, связанных с флюктуациями сопротивления полной цепи (от электрода во внешнем растворе до электрода в пипетке). Во-вторых, для того, чтобы антибиотик подействовал, требуется довольно много времени (до 30 минут), что существенно уменьшает полезный период эксперимента. И в-третьих, антибиотик повреждает мембрану также и в месте соединения с кончиком пипетки, что приводит к ускоренному разрушению гигаомного контакта и дополнительно уменьшает эффективное экспериментальное время. Таким образом, данный вариант метода может быть с успехом использован только в экспериментах, которые не требуют продолжительного времени для выявления исследуемых явлений.
|
|
|
Nuclear patch
Интересная разновидность patch-clamp — nuclear patch. (Фиксация потенциала с клеточным ядром).
Этот метод применяется в случае, когда количество исследуемых каналов на поверхностимембраны мало. Основной целью данного метода является повышение вероятности попадания единичного рецептора на пипетку путём увеличения площади отрываемого от клетки участкамембраны; сам же метод состоит в следующем. Пипетка подводится к клетке, а затем рывком пробивает мембрану. После этого кончик пипетки подводится к клеточному ядру, на пипетку подается небольшое отрицательное давление. В результате пипетка присасывается к ядру. Затем пипетка с ядром на конце плавно отводится назад и вынимается из клетки. Пипетку необходимо вывести из клетки таким образом, чтобы участок мембраны в месте выхода «наделся» на присосавшееся ядро и оторвался, обернувшись вокруг него. В результате получается специфический вариант outside-out patch, при котором гораздо больший, чем в обычном варианте метода, участок мембраны присоединён к концу пипетки, будучи обёрнутым вокруг клеточного ядра. Таким образом, вероятность нахождения нужного единичного рецептора на оторванном участке мембраны заметно повышается.
|
|
|
