 |
Определение основных групп биологически активных веществ
|
|
|
|
Тонкослойная хроматография
Приготовление растворов.
Раствор стандартного образца (СО) рутина. Около 0,001 г рутина (рутина тригидрата) растворяют в 10 мл спирта 96 %. Срок годности растворане более 3 мес при хранении в прохладном, защищенном от света месте.
Раствор СО хлорогеновой кислоты. Около 0,001 г хлорогеновой кислоты растворяют в 10 мл спирта 96 %. Срок годности растворане более 3 мес при хранении в прохладном, защищенном от света месте.
Дифенилборилоксиэтил-амина раствора 1 % в спирте 96 %. 1,0 г дифенилборилоксиэтиламина (дифенилборной кислоты аминоэтилового эфира) растворяют в 100 мл спирта 96 %. Срок годности растворане более 3 мес при хранении в прохладном, защищенном от света месте.
Полиэтиленгликоля (ПЭГ) раствора 5 % в спирте 96 %. 5 мл полиэтиленгликоля (ПЭГ) 400 смешивают со 100 мл спирта 96 %. Срок годности растворане более 6 мес при хранении в прохладном, защищенном от света месте.
Около 1,0 г сырья, измельченного до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1,0 мм, помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 10 мл спирта 96 %, нагревают с обратным холодильником на водяной бане в течение 10 мин. После охлаждения до комнатной температуры извлечение фильтруют через бумажный фильтр (испытуемый раствор).
На линию старта аналитической хроматографической пластинки со слоем силикагеля на алюминиевой подложке размером 10 × 10 см в виде полос длиной 10 мм, шириной не более 3 мм наносят 30 мкл испытуемого раствора и параллельно в одну полосу по 10 мкл растворов СО рутина и хлорогеновой кислоты. Пластинку с нанесенными пробами сушат при комнатной температуре в течение 5 мин, помещают в камеру, предварительно насыщенную в течение не менее 30 мин смесью растворителей этилацетат - муравьиная кислота безводная - вода (40:4:6) и хроматографируют восходящим способом.
|
|
|
Когда фронт растворителей пройдет около 80 – 90 % длины пластинки от линии старта, ее вынимают из камеры, сушат до удаления следов растворителей в вытяжном шкафу. Далее пластинку нагревают в сушильном шкафу 2-3 мин при 100-105 ºС и еще теплую обрабатывают последовательно дифенилборилоксиэтиламина раствором 1 % в спирте 96 % и полиэтиленгликоля раствором 5 % в спирте 96 %.
Через 30 мин после обработки пластинку рассматривают в УФ-свете при длине волны 365 нм.
На хроматограмме растворов СО рутина и СО хлорогеновой кислоты должны обнаруживаться: зона желтого, желто-оранжевого или оранжевого цвета (рутин), и зона голубого цвета (хлорогеновая кислота).
На хроматограмме испытуемого раствора должны обнаруживаться следующие зоныадсорбции: зона желтого, желто-зеленого, желто-оранжевого или оранжевого цвета на уровне зоны рутина; две зоны голубого цвета – на уровне зоны СО хлорогеновой кислоты и выше нее; допускается обнаружение дополнительных зон.
ИСПЫТАНИЯ
Влажность. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок - не более 13 %.
Зола общая. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок - не более 13 %.
Зола, нерастворимая в хлористоводородной кислоте. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок - не более 3 %.
Измельченность сырья. Цельное сырье: частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 3 мм, - не более 3 %. Измельченное сырье: частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями размером 7 мм, - не более 5 %; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,18 мм, - не более 5 %. Порошок: частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм, - не более 5 %; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,18 мм, - не более 5 %.
Посторонние примеси
Части, изменившие окраску (потемневшие и почерневшие). Цельное сырье, измельченное сырье - не более 3 %.
|
|
|
Стебли диаметром свыше 3 мм. Цельное сырье, измельченное сырье - не более 3 %.
Органическая примесь. Цельное сырье, измельченное сырье - не более 2 %.
Минеральная примесь. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок - не более 1,5 %.
Тяжелые металлы. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах».
Радионуклиды. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания радионуклидов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах».
Остаточные количества пестицидов. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания остаточных пестицидов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах».
Микробиологическая чистота. В соответствии с требованиями ОФС «Микробиологическая чистота».
Количественное определение. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок: сумма флавоноидов в пересчете на рутин - не менее 0,3 %; эфирного масла - не менее 0,2 %, экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом 70 %, - не менее 20 %.
Сумма флавоноидов
Приготовление растворов.
Раствор СО рутина. Около 0,05 г (точная навеска) рутина, предварительно высушенного при 130 – 135 °С в течение 3 ч, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и растворяют при нагревании на кипящей водяной бане в 85 мл спирта 96 %, охлаждают, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают (раствор А СО рутина). Срок годности растворане более 30 сут при хранении в прохладном, защищенном от света месте.
2,0 мл раствора А СО рутина, 4 мл алюминия хлорида спиртового раствора 2 % и 1 каплю уксусной кислоты разведенной 30 %, помещенных в мерную колбу вместимостью 25 мл доведенных спиртом 96 % до метки (раствор Б СО рутина). Срок годности растворане более 30 сут при хранении в прохладном, защищенном от света месте.
Аналитическую пробу сырья измельчают до величины частиц, проходящих через сито с отверстиями размером 1 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 60 мл спирта 70 %. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Горячее извлечение фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. После охлаждения фильтр промывают 40 мл спирта 70 %, объём извлечения доводят до метки и перемешивают (раствор А испытуемого раствора).
|
|
|
2,0 мл раствора А испытуемого раствора, помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 4 мл алюминия хлорида спиртового раствора 2 %, 1 каплю уксусной кислоты разведённой 30 %, доводят объём раствора спиртом 96 % до метки и перемешивают (раствор Б испытуемого раствора).
Оптическую плотность раствора Б испытуемого раствора измеряют через 30 мин на спектрофотометре при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 2,0 мл раствора А испытуемого раствора и 1 капли уксусной кислоты разведенной 30 % доведенный спиртом 96 % до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора Б СО рутина в таких же условиях. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 2,0 мл раствора А СО рутина, 1 капли уксусной кислоты разведенной 30 %, доведенный спиртом 96 % до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в абсолютно сухом сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле:
где A –оптическая плотность раствора Б испытуемого раствора;
A о–оптическая плотность раствора Б СО рутина;
а – навеска сырья, г;
а о – навеска СО рутина, г;
Р – содержание основного вещества в СО рутина, %;
W – влажность сырья, %.
Допускается содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин вычислять с использованием удельного показателя поглощения комплекса рутина с алюминия хлоридом по формуле:
где A –оптическая плотность раствора Б испытуемого раствора;
- удельный показатель поглощения комплекса рутина с алюминия хлоридом при длине волны 410 нм, равный 260;
а – навеска сырья, г;
|
|
|
W – влажность сырья, %.
Экстрактивные вещества. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» (метод 1, экстрагент - спирт 70 %).
Эфирные масла. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания эфирного масла в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» (метод 2, из навески 20,0 г сырья, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм, время перегонки - 3 ч).
Примечание. Определение суммы флавоноидов в пересчете на рутин проводят в сырье, предназначенном для получения лекарственных растительных препаратов (пачки, фильтр-пакеты); эфирного масла и экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом 70 %, – в сырье, предназначенном для получения настоек.
Упаковка, маркировка и транспортирование. В соответствии с требованиями ОФС «Упаковка, маркировка и транспортирование лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов».
Хранение. В соответствии с требованиями ОФС «Хранение лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов».
|
|
|
