Лекарственные вещества, связанные с моноклоналъными антителами

Лекарственные вещества, проявляющие высо­кую активность при тестировании in vitro (обыч­но в культуре клеток), зачастую оказываются значительно менее эффективными in vivo. Ка­жущееся снижение их активности объясняется тем, что они не достигают органа или клетки-мишени в нужной концентрации. Увеличение дозы принимаемого препарата не решает проб­лему, поскольку при этом часто возникают по­бочные эффекты. Более того, чтобы избежать таких эффектов, многие терапевтические сред­ства заведомо вводят в дозах, не достигающих оптимальных, что дополнительно снижает их эффективность. Для облегчения доставки ле­карственного вещества к месту его действия можно использовать моноклональные антитела. Наиболее перспективными вариантами таких методов являются:

1.Присоединение молекул лекарственных веществ к моноклональным антителам, специфичным по отношению к белкам, находящимся на поверх­ности строго определенных клеток, например опухолевых (рис. 4А).

 

2. Использование лекарст­венных веществ в неактивной форме, с после-дующим переводом их в активное состояние при помощи фермен­тов. Чтобы такое превращение происходило только вблизи клетки-мишени, фермент присо­единяют (коньюгируют) к моноклональному антителу, специ­фичному к поверхностному антигену этой клет­ки (рис. 4Б).

 

Для эффективной работы таких систем необходимо, чтобы:

а) моноклональное антитело, связанное с ферментом, пе­реводящим лекарственное вещество в активную форму, было в достаточной степени очищено и имелось в нужном количестве;

б) связывалось с высокоспецифичным для клетки-мишени бел­ком;

в) было стабильным в физиологических ус­ловиях, но в то же время быстро выводилось из кровотока;

г) при необходимости могло прони­кать в опухолевую ткань, обеспечивая действие препарата на все ее клетки.

В этом случае мише­нями оказываются строго определенные клетки, что позволяет использовать лекарственное ве­щество в гораздо меньших дозах, чем при пря­мом введении. Применение в такой системе моноклональных антител мыши может приводить к развитию иммунного ответа, поэтому очень важно использовать фрагменты антител челове­ка или антител, максимально сходных с ними по структуре.

Наиболее частой причиной смерти в странах Северной Америки и Европы является тромбо­эмболия мозговых или сердечных артерий. Тромб состоит из молекул фибрина, фактора свертывающей системы крови, образующего сеть в ответ на повреждение сосудистой стенки. В норме молекулы фибрина в образовавшемся тромбе расщепляются с помощью плазмина сериновой проте-иназы, который образуется из плазминогена под действием активатора (рис.5). Однако нередко эта биологическая система работает недостаточно эффективно, что приводит к закупорке артерий. В таких ситуаци­ях для повышения уровня плазмина в крови бы­ло предложено использовать активатор плазминогена в качестве терапевтического средства.

Однако плазмин способен разрушать и пред­шественник фибрина фибриноген (рис.5), и если уровень последнего в результате терапии с использованием активатора плазминогена сни­зится слишком сильно, могут произойти об­ширные внутренние кровотечения. Это привело к необходимости создания тромболитических препаратов, разрушающих только фибрин в тромбе. Ученые исходили из того, что если к ак­тиватору плазминогена «пришить» антитело, специфичное к фибрину, то будет происходить только локальное повышение концентрации плазмина вблизи тромба (рис.6). Для провер­ки этой гипотезы тканеспецифичный активатор плазминогена был присоединен к моноклональному антителу, специфичному в отношении фи­брина. Испытания на модельных системах пока­зали, что комплекс присоединялся к сгусткам крови и лизировал их, не вызывая значительно­го разрушения фибриногена. Были созданы и другие типы конъюгатов антитело - активатор плазминогена, тоже приводящие к локальному образованию плазмина, разрушающего кровяные сгустки.

1.7. Профилактика отторжения трансплантированных органов

В 1970-х гг. были пересмотрены взгляды на пас­сивную иммунизацию: ее стали считать профи­лактическим средством борьбы с отторжением трансплан-тированных органов. Предлагалось вводить пациентам специфические антитела, которые будут связываться с лимфоцитами оп­ределенного типа, уменьшая иммунный ответ, направленный против пересаженного органа.

Первыми веществами, рекомендованными Департаментом по контролю за качеством пи­щевых продуктов, медикаментов и косметиче­ских средств (США) для использования в каче­стве иммуносупрессоров при пересадке органов у человека, были моноклональные антитела мы­ши ОКТЗ. За отторжение органов отвечают так называемые Т-клетки - лимфоциты, дифферен­цирующиеся в тимусе. ОКТЗ связываются с ре­цептором, находящимся на поверхности любой Т-клетки, который называется CD3. Это преду­преждает развитие полного иммунного ответа и отторжение трансплантированного органа. Подобная иммуносупрессия весьма эффективна, хотя и оказывает некоторые побочные действия, например, вызывает лихорадку и приводит к появлению сыпи.

 

Системы ДНК-диагностики

Информация обо всем многообразии свойств ор­ганизма заключена в его генетическом материа­ле. Так, патогенность бактерий определяется наличием у них специфического гена или набо­ра генов (гены вирулентности), а наследственное генетическое забо­левание возникает в результате повреждения определенного гена. Сегмент ДНК, детермини­рующий данный биологический признак, имеет строго определенную нуклеотидную последова­тельность и может служить надежным диагностическим маркером.

В основе многих быстрых и надежных диаг­ностических методов лежит процесс гибридизация нук­леиновых кислот - спаривание двух компле­ментарных одноцепочечных сегментов разных молекул ДНК. Процедура в общих чертах состоит в следую­щем.

1. Разрушение биологического образца (клетки, ткани), выделение молекул ДНК

и их разрушение до одноцепочечных фрагментов.

2. Фиксация одноцепочечной ДНК - мишени на твердой подложке, например

мембранном фильтре или на поверхности лунки.

3. Обработка подложки раствором, содержащим меченые одноцепочечные

молекулы ДНК-зонда, которая при определенных условиях (температуре и рН раствора) спаривается с ДНК-мишенью.

4. Промывка фильтра для удаления избытка несвязавшихся молекул ДНК-зонда.

5. Детекция гибридных молекул ДНК-зонд/мишень.

В диагностических тестах, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот, ключевы­ми являются три компонента: ДНК-зонд, ДНК-мишень и метод детекции гибридизационного сигнала. Система детекции должна быть в выс­шей степени специфичной и высокочувстви­тельной.

Весьма желательно, чтобы ДНК-диагностику можно было проводить на исходном материале, без дополнительного его культивирования или выделения нуклеиновых кислот, особенно в тех случаях, когда тестируются клинические образ­цы. Исследователи с успехом проводят гибридизацию с ДНК-мишенями, присутствующими в образцах кала, мочи, крови, смывах из зева и в тканях без предварительной их очистки. Если концентрация последовательности-мишени в исследуемом образце слишком мала, ее можно амплифицировать (увеличить,наработать) с помошью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Получены и охарактеризованы более 100 раз­личных ДНК-зондов, позволяющих обнаружи­вать патогенные штаммы различных бактерий, вирусов и паразитических простейших. Так, име­ются зонды для диагностики бактериальных ин­фекций человека, вызываемых Legionella pneumophila (респираторные заболевания), Salmonellatyphi (пищевые отравления), Campylobacter hyoin-testinalis (гастриты), а также для выявления энтеротоксичного штамма Escherichia coli (гастроэн­териты). Однако это лишь «верхушка айсберга»; в принципе с помощью гибридизации можно вы­являть практически любые патогенные микроор­ганизмы.

 

Примеры ДНК-диагностики

Диагностика малярии

В качестве примера использования ДНК-зондов для диагностики заболеваний можно привести процедуру обнаружения Plasmodium falciparum. Этот паразит вызывает малярию, заболевание, угрожающее примерно трети всего населения Земли. Он инфицирует эритроциты и разрушает их, что приводит к развитию лихорадки, а в тя­желых случаях — к поражению мозга, почек и других органов. Чтобы выявить источники ин­фекции, оценить эффективность мер по их лик­видации и обеспечить раннюю диагностику и лечение, необходимы достаточно чувствитель­ные, простые и недорогие методы. В настоящее время малярию диагностируют с помощью мик­роскопического исследования мазков крови - эффективного, но трудоемкого и занимающего много времени процесса. Иммунологические методы обнаружения Plasmodium, такие как ELISA, достаточно быстрые и их легко автома­тизировать, но с их помощью нельзя отличить текущую инфекцию от прошедшей, поскольку при этом определяется только наличие антител к Plasmodium в крови больных.

Для избирательной ДНК-диагностики теку­щей инфекции, т. е. для выявления ДНК возбу­дителя, в качестве основы используются высокоповто-ряющиеся последовательности ДНК P. falciparum. В качестве специфического зонда вы­бирается последовательность, гибридизующаяся с ДНК P. falciparum, но не с ДНК P. vivax, P. cynomolgi или с ДНК человека. С его помощью можно обнаружить всего 10 пг очищенной ДНК Plasmodium falciparum или 1 нг той же ДНК в крови больного.

⇐ Предыдущая123

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: