 |
Схема глицеринового брожения
|
|
|
|
Лекция № 3
Понятие о первичных и вторичных метаболитах.
Все продукты клеточного метаболизма условно можно разделить на первичные и вторичные метаболиты. Четкого и однозначного критерия отнесения того или иного метаболита к первичному или вторичному не существует, однако в литературе существует два основных мнения на этот счет. Одни авторы считают, что первичными метаболитами являются все метаболиты образующиеся в процессе нормальной жизнедеятельности клетки, как анаболиты (белки, полисахориды, липиды и др.) так и катаболиты (этанол, органические кислоты, СО2 и др). К вторичным метаболитам (идиолитам) они относят различные специфические соединения, которые могут образовываться как ответ на воздействие различных внешних факторов, которые приводят к нарушению нормальных метаболитических процессов. К таким неблагоприятным факторам относятся нехватка питательных веществ, загрязнение культуральной среды продуктами метаболизма, добавление различных токсичных веществ и т.д. Эти соединения (антибиотики, стероиды, алкалоиды) играют важную роль при выживании продуцента в неблагоприятных условиях (так при нехватке питательных веществ антибиотики подавляют рост микроорганизмов – конкурентов, а многие растительные алкалоиды подавляют рост фитопатогенной микрофлоры) и часто участвуют в нейтрализации самих внешних воздействий или их последствий (см. спиртовое брожение в щелочной среде). Некоторые авторы утверждают, что вторичные метаболиты не имеют большого значения для выживания клеток. Однако этим утверждением они противоречат сами себе, так как совершенно очевидно, что, например, именно антибиотики резко повышают шансы выживания продуцирующих их микроорганизмов в условиях нехватки питательных веществ. Кроме того, промежуточные продукты первичного метаболизма, полезные с точки зрения человека, могут образовываться в больших количествах только при нарушении нормальных метаболитических процессов в клетке, т.е. в условиях обеспечивающих их сверхсинтез, они фактически становятся вторичными метаболитами.
|
|
|
Другие авторы считают, что к первичным метаболитам можно относить только белки-ферменты. Все остальные соединения являются вторичными метаболитами – продуктами катализируемых ферментами реакций.
В пользу того или другого утверждения есть свои “за” и “против”, однако более общепринятым в биотехнологии является первое утверждение.
Теоретические основы получения первичных метаболитов.
Многие промежуточные и конечные продукты клеточного метаболизма могут представлять интерес для человека как сырье для химической пищевой и фармацевтической промышленности или использоваться непосредственно. Однако если получение конечных продуктов метаболизма не представляет большой проблемы, поскольку процесс их синтеза происходит естественным путем, то получение промежуточных продуктов метаболизма или продуктов вообще не характерных для данного продуцента представляет большую проблему. Поэтому, лишь научившись контролировать и управлять процессами метаболизма, можно получать эти продукты в любом необходимом количестве. Это тем более актуально, что получение их альтернативным путем химического синтеза или из животного или растительного сырья, весьма трудоемко, экономически невыгодно или вообще невозможно.
Все процессы клеточного метаболизма (катаболизма), в зависимости от того протекают ли они с использованием кислорода или без него делятся на аэробные и анаэробные.
Анаэробные процессы.
Примером анаэробных процессов используемых в промышленной биотехнологии являются процессы брожения. Брожение – это одна из разновидностей биологического окисления субстрата у гетеротрофных микроорганизмов в целях получения энергии, когда акцептором электронов или атомов водорода являются органические вещества.
|
|
|
В основе многих бродильных процессов лежит универсальный, включающий в себя 9 реакций, процесс превращения глюкозы (источник углерода) в ключевой промежуточный продукт (интермедиат)-пировиноградную кислоту (ПВК) или пируват из которого далее могут образовываться различные конечные продукты. По конечному продукту, образующемуся в наибольшем количестве различают молочнокислое (молочная кислота - лактат), спиртовое (этанол), маслянокислое, ацетон-бутанольное и т.д.
Ход процесса спиртового может заметно меняться в зависимости от условий его проведения. Так если в емкость, где протекает процесс спиртового брожения добавлять NaHSO3 - бисульфит (гидросульфит) натрия, то он будет связывать образующийся ацетальдегид и получающееся соединение, в отличие от ацетальдегида, не сможет восстанавливаться молекулами НАD*Н.
В таких условиях акцептором электронов (атомов водорода) от НАД*Н становится не ацетальдегид, как это происходит при нормальном протекании спиртового брожения, а фосфодиоксиацетон, превращающийся в глицерин-фосфат, гидролиз которого приводит к образованию глицерина. Образование этанола в этом случае не происходит.
Такой метод модификации нормального метаболизма дрожжей лег в основу одного из самых первых “современных” биотехнологических производств. Промышленное производство глицерина микробиологическим способом из крахмалсодержащего сырья (картофель, сахарная свекла), было налажено в Германии во время первой мировой войны.
СХЕМА ГЛИЦЕРИНОВОГО БРОЖЕНИЯ
Другим примером нарушения нормального метаболизма дрожжей, хотя и не нашедшем практического применения, является спиртовое брожение в щелочной среде. Нормальный процесс требует для своего протекания слабокислой среды (рН=4,0-5,0). При увеличении значения рН выше нормы происходит изменение нормального метаболизма дрожжевых клеток. Образующиеся из ПВК две молекулы ацетальдегида перестают восстанавливаться НАД∙Н и начинают диспропорционировать с образованием одной молекулы этанола и одной молекулы уксусной кислоты, которая, взаимодействуя со щелочью, возвращает величину рН к нормальному значению. Роль акцептора водородов в это время выполняют молекулы фосфодиоксиацетона (по аналогии с процессом глицеринового брожения).
|
|
|
С энергетической точки зрения глицериновое брожение и брожение в щелочной среде менее выгодны, по сравнению с процессом нормального спиртового брожения (1 молекула АТФ на 1 молекулу глюкозы). Однако эти метаболитические пути являются альтернативными, запасными вариантами гликолиза, позволяющими клеткам не только выжить в неблагоприятных условиях, но и нейтрализовать их.
Аэробные процессы
Все аэробные процессы окисления, протекающие в клетках, можно разделить на две группы:
а). Завершающиеся неполным окислением субстрата
б). Завершающиеся полным окислением (до СО2 и Н2О)
Наиболее распространенная схема полного окисления глюкозы и других углеводов включает в себя расщепление глюкозы до 2 молекул ПВК, их окислительное декарбоксилирование до 2 молекул ацетил-КоА и полное их окисление в цикле Кребса (цикле трикарбоновых кислот, ЦТК). Суммарно процесс можно представить следующим уравнением:
С6Н12О6 + 6О2 à 6CO2 + 6H2O + 38 АТФ
По похожей схеме (через образование ацетил-КоА) протекает полное окисление органических кислот, углеводородов, глицерина, ряда аминокислот.
При неполном окислении процесс останавливается на стадии образования какого ни будь промежуточного соединения (чаще всего кислоты).
Для получения целевых продуктов в аэробных процессах используют два основных подхода:
а). Если целевой продукт является конечным продуктом неполного окисления, то стараются создать оптимальные условия для его максимального и быстрого накопления (подбор значений рН, температуры, концентрации питательных веществ, добавление активаторов ферментов, отвечающих за синтез продукта, отвод, удаление избыточных количеств продукта).
|
|
|
б). Если целевой продукт является промежуточным метаболитом (кислоты цикла Кребса), то в любой момент времени его концентрация в клетке ничтожно мала. Чтобы обеспечить его сверхсинтез и накопление проводят целенаправленное вмешательство в нормальный процесс метаболизма, заключающееся в избирательном блокировании (ингибировании) одной или нескольких последующих стадий превращения этого целевого продукта. При этом в клетках обязательно должны функционировать альтернативные механизмы ресинтеза некоторых, ключевых жизненно важных промежуточных метаболитов, например щавелевоуксусной кислоты для ЦТК. Часто, для уменьшения эффекта ретроингибирования, целевой продукт стараются вывести из клеток, например, за счет увеличения проницаемости клеточных оболочек или из культуральной жидкости (высаждение в осадок, удаление в виде газа).
Процессы с неполным окислением.
Классическими примерами таких процессов, нашедших применение в биотехнологии являются процессы получения уксусной, глюконовой и итаконовой кислот.
1 .Получение уксусной кислоты и столового уксуса.
Микробиологический способ получения уксусной кислоты состоит в частичном окислении этанола до уксусной кислоты при участии бактерий штаммов Acetobacter и Gluconobacter иммобилизованных (закрепленных) на различных носителях (буковая стружка). Таким способом в настоящее время получаю только пищевой уксус.
Техническую уксусную кислоту получают химическим способом по реакции Кучерова или сухой перегонкой древесины.
|
|
|
