Электронная микроскопия и ее виды

Электронная микроскопия использует для "просвечивания" морфологи­ческих объектов пучок электронов. Пучок электронов испускается электрон­ной пушкой в условиях высокого вакуума и ускоряющего напряжения. Да­лее этот пучок фокусируется при помощи электромагнитов (электромаг­нитные линзы). Сфокусированный пучок направляется на изучаемый объект, имеющий структуры с различной электронной плотностью. Прой­дя через объект, пучок электронов падает на люмииесцирующий экран, на котором и создает плоскостное изображение структур объекта. Это изобра­жение может быть сфотографировано. Общий вид электронного микроско­па показан на рис. 2.4.

Разрешающая способность современных электронных микроскопов равна 0,1 нм (в 200 000 раз выше, чем световых микроскопов), а увеличе­ние — 1 миллион раз. Описанная разновидность электронной микроско­пии называется просвечивающей (трансмиссионной). Используя ее, можно изучить тонкое внутреннее строение клеток и межклеточных структур. Сканирующие, или растровые, микроскопы позволяют увидеть трехмерное изображение объекта, его поверхность. Принцип работы растрового элект­ронного микроскопа заключается в том, что пучок электронов последова­тельно движется по поверхности гистологического объекта, на которую предварительно напылено твердое вещество. Под действием пучка элект­ронов выбиваются вторичные электроны, которые регистрируются телеви­зионным экраном. Так последовательно "высвечивается" (сканируется) вся поверхность гистологического объекта. Рис. 2.5 демонстрирует изображе­ния объектов, получаемые с помощью трансмиссионного и сканирующего электронных микроскопов.

Высоковольтная трансмиссионная электронная микроскопия за счет увеличения ускоряющего напряжения обеспечивает огромную скорость движения электронов. Благодаря этому они значительно глубже, чем при обычной трансмиссионной микроскопии, проникают в изучаемый объект. Высоковольтный микроскоп (рис. 2.6) дает высокую разрешаю­щую способность и позволяет изучать срезы до нескольких микромет­ров толщиной.

ГИСТОХИМИЯ

В основе гистохимических ме­тодов исследования лежит использование химических реакций для изучения различных химических компонентов клеток и тканей. Со­временные гистохимические мето­ды позволяют выявлять в клетках аминокислоты, белки, жиры, угле­воды, минеральные вещества и другие продукты. Принцип гисто­химических реакций состоит в том, что используются красители, которые избирательно связывают­ся только с теми химическими со­единениями клетки, которые необ­ходимо изучить, и окрашивают их, делая видимыми. Важный раз­дел гистохимии — гистохимия ферментов. При помощи гисто­химии ферментов можно опреде­лить активность многих фермен­тов, изучать обмен веществ в клет­ках и тканях. Активность фермен­тов при этом определяется по окра­шиванию конечного продукта реакции. Поскольку гистохимические методы позволяют оценивать функции клеток и тканей, их относят к морфофункциоиальным методам (рис 2.7).

Разновидностью гистохимии является также иммуногистохимия (иммуноцитохимия). Иммуногистохимические методы основаны на реакциях ан­тиген-антитело. Каждая клетка организма имеет свой разнообразный спе­цифический антигенный состав. К любому антигену можно путем имму­низации выработать специфические (моноклональные) антитела, которые затем соединяются с флуорохромом (например, флуоресцеинизотиоциона-том, или сокращенно ФИТЦ). Нанесенные на гистологический объект, та­кие антитела специфически метят только клетки, несущие антигены, на которые они выработались. Методы иммуногистохимии используются для определения степени дифферепцировки клеток (в процессе дифференцировки происходит последовательная смена поверхностных клеточных ан­тигенов), а также для выявления различных веществ в клетке. В последнее время принципы светомикроскопической гистохимии ус­пешно перенесены в электронную микроскопию. Это привело к возникновение электронномикроскопической цито- и гистохимии и электронной им-муноцитохимии (иммуногистохимии). Эти методы основаны на получении высокоэлектронноплотных продуктов цито- (гисто)химических реакций. Светомикроскопическая и электронномикроскопическая цито- (гисто- имму­нохимия также являются морфофункциональными методами, позволяю­щими изучать не только структуру, но и функции клеток и тканей.

ГИСТОАВТОРАДИОГРАФИЯ — метод, основанный на использова­нии радиоизотопов — веществ, излучающих поток электронов. Для этого изотопами метят различные предшественники синтеза веществ в клетке: нуклеотиды, аминокислоты и другие. Затем эти меченые вещества вводят в клетку (в организм), и они включаются в синтетические процессы. Далее из ткани делают срезы и наносят на них фотоэмульсию, которая под влиянием излучаемых электронов засвечивается. Чем больше засвечивание, тем интен­сивнее идет процесс включения изотопов в ткани, тем интенсивнее обмен в клетке. В последнее время разработаны методы электронной цито-(гисто-) ауторадиографии. Так же, как и гистохимические методы, гистоавторадиог-рафия является морфофункциональным методом исследования.

ПРИЖИЗНЕННАЯ МИКРОСКОПИЯ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. Для прижизненной (витальной) микроскопии можно использовать метод куль­туры тканей, когда клетки помещаются на искусственную питательную среду и затем на ней культивируются. На такой среде они растут в виде монослоя. Эти клетки можно затем окрашивать и микроскопировать. Для прижизненного исследования клеток используются также методы виталь­ного (прижизненного) окрашивания клеток нетоксичными красителями (метиленовый синий, трипаповый синий, кармин). Эти красители дают не растворы, а эмульсии, которые активно фагоцитируются клетками и визу-

ализируют их. Суправитальная микроскопия основана на связывании кра­сителя живыми тканями, изъятыми из организма. Например, так окрашивают нерные клетки при помощи метиленовОго синего. Таким образом, разница между витальной и суправиталыюй микроскопией заключается в том, что в первом случае окрашивание клеток и тканей идет в живом организме до изъятия из него органа или его части, тогда как во втором случае оно про­водится в живом, но изъятом из организма органе (части органа, ткани).

Для изучения живых клеток используют также метод цейтраферной съемки (киносъемки). При этом клетки в культуре тканей фотографируют с интервалами в 5 минут. Снятый таким образом фильм демонстрируют с частотой 24 кадра в секунду. При этом за короткое время можно увидеть все изменения, произошедшие с клетками в течение длительного времени. Цейтраферная съемка позволяет, например, проследить изменения, проис­ходящие в клетке при митотическом делении и др.

ЦИТОМИКРОХИРУРГИЯ — метод, позволяющий производить на клетке микрооперации — удаление частей клетки, пересадку ядра из одной клетки в другую и т.д. С этой целью используют специальный прибор микроманипулятор.

В гистологии широко используют также метод трансплантации тканей. Для этого кусочки органов или тканей пересаживают в различные участки тела животных-реципиентов. Далее изучают поведение трансплантатов, процессы жизнедеятельности в них и взаимоотношения их с тканями ре­ципиента.

МЕТОД ГИБРИДИЗАЦИИ. Этот метод основывается на специфи­ческом связывании участков ДНК с комплементарными им маркирован­ными фрагментами РНК или ДНК (так называемые зонды). Метод позво­ляет выявлять последовательность нуклеотидов в РНК и ДНК и, следова­тельно, локализацию определенных генов и продуктов их деятельности.