Способы выделения целевого продукта.

В большинстве микробных систем продукты, синтезируемые микроорганизмами продуцируются из клетки непосредственно в среду, в связи с чем эффект обратного ингибирования продуктом реакции очень мал. В отличие от микробных, растительные клетки не обладают способностью к экскреции и образующиеся вторичные метаболиты накапливаются в клеточной стенке или внутриклеточных органеллах. Поэтому, как правило, в культуре растительной ткани при увеличении концентрации продукта в клетке выше пороговой, срабатывает эффект ретроингибирования, вследствие чего дальнейшее накопление вещества прекрат­ится. Данное явление часто обуславливает низкое содержание искомых веществ в клетках культуры. Чтобы избежать этого эффекта, рядом исследователей неоднократно предпринимались попытки удалять продукт реакции по мере его синтеза из клетки. Так, для увеличения проницаемости клеток Cinchona ledgeriana в культуре и ускорения выхода внутриклеточных алкалоидов пытались применить диметилсульфоксид (ДМСО) – вещество повышающее проницаемость клеточных мембран кожи человека. Однако в этом случае ДМСО оказался непригодным для индукции выделения. Даже при высокой концентрации ДМСО высвобождение алкалоидов протекало медленно, а большинство обработанных мембран не восстанавливалось.

Для некоторых суспензионных культур весьма экономичным оказал­ся способ выращивания в виде двухфазной системы, при интенсивном перемешивании. Такая культура состоит из водной фазы (питательная среда с растущими клетками) и нетоксичной липофильной фазы (триглицериды или парафины). В ре­зультате липофильные вещества, синтезируемые клетками в процессе их роста, переходят в липофильную фазу. Например, корончатогалловая опухолевая суспензионная культура Matricaria chamomilla росла в двухфазной системе, состоящей из водного раствора пита­тельной среды и нетоксичной липофильной фазы (триглиперид миглиол) в течение 22 дней. В результате жирорастворимые продукты, синтезируемые культурой ткани ромашки, накапливались в фазе миглиола в концентрации, в 60 раз большей, чем в однофазной системе. Красящий продукт нафтохинон шиконин, продуцируемый суспензион­ной культурой Lithospermim erythrorhizon, не растворяется в во­де, но растворяется в некоторых органических растворителях. Это, свойство шиконина использовано при выращивании ткани в двухслой­ной культуре. В качестве органического растворителя был взят гексадекан, который растворял 81% синтезируемого клетками шикони­на. Причем культура прекращала синтез шиконина, если он из клеток не переходил в органический слой.

 

Культуры органов растений

Как мы уже отмечали, в том случае, когда в растении образование и накопление ценных метаболитов происходит в различных, специализированных клетках, образование их в значительных количествах в недифференцированных клетках культуры мало вероятно. В таких случаях, по-видимому, более целесообразным является выращивание различных организованных (органных) структур (побеги, корни, эмбриоиды).

 

3.1. Культура побегов.

Культуру побегов можно получить из меристематических тканей, способных сформировать побег (зародыш, кончик побега или образу­ющейся позже пазушный побег, точки роста, культуры клеток и тка­ней и т.д.). Кончики побегов или микрочеренки, культивируемые на питательных средах в условиях in vitro, развивают побеги второго порядка, третьего и т.д., образуя в результате агрегат, состоящий из почек, побегов и иногда каллуса, и заполняя почти весь сосуд, в котором проводится культивирование.

Такую культуру побегов можно разделить на отдельные по­беги, пересадить на свежую питательную среду, и продолжать, таким образом, выращивание бесконечно долго.

Подобные культуры побегов могут эффективно продуцировать ши­рокий спектр вторичных продуктов, причем часто в больших количе­ствах, чем в соответствующей культуре ткани или в растении.

Культуры тканей, полученные от различных видов Digitalis, бы­ли способны синтезировать только лишь следовые количества сердеч­ных гликозидов, в то время как культура побегов D.lanata синте­зировала дигоксин - 9 мг% от массы сухой культуры. При этом побеговые культуры росли быстрее, чем культура ткани.

Культура побегов Rauwolfia serpentina пятилетнего возраста содержала алкалоиды, характерные как для корня, так и для побе­гов исходного растения, причем их общее содержание в культуре побегов было большим, чем в побегах взрослого растения, но мень­шим, чем вкорнях.

Преимущества таких культур не только в том, что они, как правило, более способны к синтезу вторичных продуктов, но и в том, что культура побегов содержит 10-15% сухого вещества, в то время в культуре ткани обычно не более 5% сухой массы.

Имеется опыт культивирования побегов в многолитровых ферменте­рах по технологиям, аналогичным используемым в микробиологичес­кой промышленности для получения продуктов жизнедеятельности гри­бов и микроорганизмов.

 

 

Культура корней

Значение подземных органов как лекарственного сырья общеизвест­но. Культура изолированных корней in vitro,наряду с культурами изолированных тканей и клеток является одним из удобных методов исследования физиологии и биохимии растений, т.к. в системе органов рост тканей и экспрессия вторичного метаболизма неразрывны. Корневые культуры многих растений способны к синтезу ценных продуктов. Однако корни в культуре растут очень медленно и не могут служить промышленным источником вторичных метаболитов.

Поэтому в последние годы проводится культивирование органов, клетки которых трансформированы с помощью Ti -плазмиды Agrobacterium. В результате такой трансформации их биомас­са увеличивается значительно быстрее без прекращения синтеза вторич­ных метаболитов. Проведенные исследования трансформированных корней (трансгенный корень, волосатый корень, hairy root) показали их высокие биосинтетические способности и экономическую ценность продуктов, синтезируемых в них.

Первые результаты были получены с волосатыми корнями белены, дурмана, белладонны, скополии, синтезирующих тропановые алкало­иды и сохраняющих эту способность в трансформированных корнях. Позднее аналогичные результаты были получены с волосатыми кор­нями Beta vulgaris и Nicotiana tabacum. Эти культуры синтезирова­ли характерные для растений продукты, причем в тех же количествах, что и корни растений.

Для получения антилейкемических алкалои­дов из Catharanthus roseus так же более предпочтительной является трансформированная корне­вая культура. Она более стабильна по продуктивности и физиологи­ческим показателям и в большей степени, чем культура побегов, спо­собна к синтезу продуктов, характерных для корней родительского растения. Такая культура на 32 день выращивания содержала около 20 алкалоидов, главным из которых был аймалицин (200 мкг на I г сырой массы).

Волосатые корни способны к быстрому наращиванию биомассы. Так, Datura stramonium за 21 день культивирования увеличила массу во­лосатых корней в 55 раз. Значительной продуктивности достигла культура волосатых корней Datura stramonium и по содержанию скополамина - 0,556 от сухой биомассы.

Получены зеленеющие культуры трансформированных корней (Bidenssulphurens), что увеличивает возможности синтеза вторичных мета­болитов, т.к. образование многих веществ (хинолизидиновые, гармаловые алкалоиды, некоторые фенольные соединения и др.) связано с хлоропластами.

Таким: образом, культура органов - это еще одна перспективная биотехнологическая модель культивирования растений для получения ценных продуктов их биосинтеза. Однако для того, чтобы стать про­мышленным источником, необходимо:

а) разработать биотехнологические установки для крупно-масштабного выращивания органных культур;

б) получить штаммы с высоким содержанием целевого продукта;

в) совершенствовать способы выделения и очистки целевого продукта.

⇐ Предыдущая1234

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: