 |
Культивирование протопластов
|
|
|
|
Л Е К Ц И Я №9
Процессы и технологии, рассматриваемые нами до настоящей лекции в основном относились к разделу биотехнологии, называемому “Промышленная микробиология” или “Технология микробиологических производств”, и основывались на использовании метаболитических процессов в различных простейших, одноклеточных микроорганизмах (бактериях, дрожжах, микрогрибах). Во многом эти технологии можно назвать технологиями “вчерашнего дня”. Определяющими направлениями как современной биотехнологии так и биотехнологии будущего, являются клеточная и генетическая инженерия, возникшие за последние 30-40 лет
Клеточная инженерия
Основным объектом клеточной инженерии являются протопласты. Они представляют собой растительные животные или иные клетки, полностью лишенные клеточной оболочки, но сохраняющие способностью осуществлять активный метаболизм, а также реакции биосинтеза и трансформации энергии. Их внутриклеточное содержимое ограниченно только цитоплазматической мембраной. Поэтому протопласты являются уникальной моделью для цитологических и биохимических исследований, и получения новых не существующих в природе организмов с необычными свойствами..
Получение протопластов
Впервые протопласты растительных клеток были получены при изучении плазмолиза (в 1892 г.) в клетках водного растения – телореза. Способ получения был весьма простым (если не сказать примитивным). Тонкая полоска ткани растения выдерживалась сначала в 0,1 М растворе сахарозы до тех пор, пока протопласт не «сожмется» и не отойдет от клеточных стенок, затем бритвой делался разрез полоски, и протопласты высвобождались в среду. Такого рода методические приемы выделения протопластов получили название механических. Подобные методы имеют определенные ограничения: 1) с помощью их можно получить только небольшое количество протопластов; 2) можно использовать только те ткани, в клетках которых при данном способе может иметь место выраженный плазмолиз; 3) из зрелой ткани таким методом протопласты получаются с большим трудом; 4) метод довольно длительный и трудоемкий.
|
|
|
Принципиально отличающимся методом является ферментативный способ получения протопластов, при котором клеточная стенка удаляется с помощью ферментов. Таким методом уже в 1919 г. были получены протопласты клеток грибов в результате обработки их клеточных стенок ферментным комплексом, содержащимся в желудочном соке виноградной улитки Helix pomatia. Некоторые виды актиномицетов так же способны продуцировать ферменты лизирующие оболочки различных эукариотических клеток, в частности грибов. В микробиологических экспериментах протопласты получались путем разрушения клеточных стенок бактерий ферментом лизоцимом, выделяемым из белка куриных яиц. Изолирование протопластов растительных клеток с использованием ферментных препаратов было осуществлено в I960г. Е. Коккингом (Великобритания). Для получения протопластов наиболее пригодны клетки находящиеся в логарифмической стадии (Log-фазе) роста клеточной культуры.
По сравнению с механическими способами ферментативные методы получения протопластов имеют определенные преимущества:
1) можно одновременно получить большое количество протопластов;
2) формирующиеся протопласты не подвергаются сильному осмотическому
сжатию;
3) клетки остаются менее поврежденными;
4) метод сравнительно быстрый.
Для удаления клеточной стенки при получении растительных протопластов используются ферментные препараты трех типов – целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Действие этих ферментов состоит в деструкции основных компонентов клеточной стенки, обеспечивающих ее механическую прочность (ригидность). У растительных клеток этими компонентами являются целлюлоза, гемицеллюлоза и пектиновые вещества, которые находятся в клеточной стенке в различных соотношениях. Поэтому комбинации ферментных препаратов и их количественные соотношения и время обработки должны эмпирически подбираться для каждого конкретного случая (т.е. в зависимости от вида растения, его возраста и органа, из которого берется материал для получения протопластов). Формирующиеся протопласты должны находиться в контакте с ферментами минимальное время, после чего их необходимо тщательно отмыть. При этом на всех стадиях необходимо поддерживать жесткие асептические условия. Стерилизация используемых ферментных растворов производится, как правило, путем фильтрования через бактериальные фильтры. Поскольку протопластированные клетки лишены жесткой оболочки, то они становятся очень чувствительными к перепадам концентраций различных веществ внутри клетки и снаружи, в культуральной среде (осмотический шок). Поэтому для отмывки от ферментов нельзя использовать дистиллированную воду, а культивирование протопластов осуществляют на специально подобранных, так называемых гипертонических средах, содержащих различные осмотические стабилизаторы (обычно сорбитол, маннитол в концентрации примерно 125 мг/л). Кроме осмотических свойств среды должны быть подобраны и другие условия. Например, протопласты чаще всего получают в темноте или при слабом освещении. Температурные условия могут варьировать в пределах; 22-280С, стабильности протопластов в определенной степени способствуют высокие концентрации двухвалентных ионов кальция и магния, воздействующих на мембранные системы клетки. Значение рН среды для культивирования протопластов должно быть в проделах 5,5-5,8. Уменьшение рН среды до 3.5 приводит к быстрому (за несколько минут) разрушению и гибели протопластов большинства видов растений.
|
|
|
Культивирование протопластов
Для культивирования протопластов используются два методических приема: инкубирование в каплях жидкой среды и помещение в агаровый слой. Естественно, что каждый из них имеет свои преимущества и свои недостатки.
|
|
|
В первом случае обеспечивается хороший обмен газами через воздушную фазу и легкая диффузия в раствор выделяемых продуктов обмена. Помимо этого, к растущим протопластам можно легко добавлять свежую питательную среду в желаемых концентрациях. Однако при этом способе протопласты имеют тенденцию агрегировать в центре капли, что препятствует наблюдению за судьбой индивидуальных колоний протопластов.
В соответствии со вторым методом определенный объем взвеси протопластов в жидкой среде добавляется к равному объему 1%-ной расплавленной и охлажденной агаризованной среды того же состава. После уплотнения (затвердевания) среды протопласты оказываются разобщенными друг от друга и фиксированными в одном положении, что обеспечивает наблюдение за развитием индивидуальных протопластов – формирование клеточной стенки, деление клеток и дальнейшие превращения. Недостатком метода является возможность механического повреждения протопластов при смешивании с агаром, а также температурные воздействия расплавленной среды при ее недостаточном охлаждении.
Существуют различные усовершенствованные модификации описанных выше методов культивирования протопластов. Удобным методом является культивирование протопластов в малом объеме жидкой питательной среды (до 1 мкл), метод получил название микроизоляции отдельных протопластов.
Очень важной проблемой клеточной инженерии растительных организмов является регенерация протопластов. Синтез клеточной стенки у образовавшихся протопластов практически начинается сразу после удаления раствора ферментов, вызвавших ее деструкцию, что можно относительно легко наблюдать с помощью флюоресцентного микроскопа. Для предотвращения преждевременной регенерации в питательную среду вводят кумарин в концентрации 200-250 мг/л. Если регенерация клеточных стенок – процесс достаточно распространенный у протопластов, то добиться деления сформировавшихся из протопластов клеток значительно труднее, а еще труднее получение из растительных протопластов целых растений.
|
|
|
Возможность регенерации растений из протопластов,обнаруженная в 1970 г, является свидетельством сохранения у них свойства тотипотентности. Регенерация растений осуществляется либо посредством эмбриогенеза, либо в процессе развития каллуса с последующей индукцией морфогенеза, посредством подбора оптимальных уровней гормонов, стимулирующих соответствующие этапы эмбриогенеза или морфогенетического процесса
Слияние протопластов
Некоторые изолированные протопласты за тот короткий промежуток времени, пока они не образуют клеточную стенку, могут сливаться друг с другом, т.е. ведут себя подобно половым клеткам. Такое слияние является спонтанным и происходит чаще, если используются протопласты, полученные из молодых тканей или из суспензионных культур клеток. Однако этот процесс может быть стимулирован путем добавления определенных веществ, что позволяет осуществить слияние не только протопластов одного вида, но и гетерологичных (парасексуальная гибридизация). Таким способом удалось даже получить регенерированное растение после слияния протопластов растения табака двух видов.
Довольно эффективным индуцирующим слияние протопластов агентом оказался полиэтиленгликоль (ПЭГ), обеспечивающий сильную адгезию протопластов. С его помощью были получены гибриды протопластов растений и животных клеток, протопласты растений и водорослей. Недостатком данной техники является то, что с ее помощью не удается получить большое количество слившихся протопластов за один прием. Другим способом стимулирования слияния является электропорация – кратковременная обработка культуры протопластов электрическими импульсами высокого напряжения. При всех методах на первом этапе происходит агрегация протопластов вследствие, как полагают, изменений их поверхностного потенциала. Последующее воздействие индукторов слияния сводится к определенным изменениям структуры мембран, увеличивающим их слипаемость и текучесть. Слияние, индуцируемое электрическими импульсами, возникает, вероятнее всего, в результате диэлектрического разрушения (пробоя) соприкасающихся участков мембран протопластов. Вокруг возникающей «дырки» возможен обмен молекулами липидов с образованием липидных мостиков, что, в конечном счете, приводит к слиянию мембран, поскольку возникает энергетически более выгодное состояние, нежели при наличии двух поврежденных мембран.
|
|
|
