Методические указания к самостоятельной работе

Количественное определение антител к тиреоглобулину (Тг) или к тиреопероксидазе (ТПО) ИФА.

 Аутоиммунные заболевания щитовидной железы характери­зуются присутствием в сыворотке крови антител к одному или более тиреоидным антигенам. Присутствие аутоантител к тиреоглобулину важно для этиологии острых и подострых нарушений функции щитовидной железы. Нормальное со­держание антител у здорового человека – менее 100 МЕ/мл.

Принцип метода. Используется метод иммуноферментного анализа. Лунки планшетов покрыты тиреоглобулином. При внесении в лунки образцов пациентов происходит образование комплекса «АТ+АГ». Антиген, сорбированный на плашке, связывается с антителами, содержащимися в образцах пациен­тов. Комплекс «АГ+АТ» выявляется конъюгатом мышиных моноклональных антител с пероксидазой к имму­ноглобулину G человека.

 

Реактивы и оборудование:

- набор для определения AT к тиреоглобулину (готовый, коммерческий) содержит все необходимые компоненты для анализа;

- термостат;

- одно- и многоканальные пипетки;

- вихревой смеситель;

- спектрофотометр;

- серная кислота.

 

Приготовление реактивов:

- приготовление коньюгата: развести конъюгат промывоч­ным раствором (титр разведения указан в инструкции), тщательно перемешать. Срок хранения при t= +2-8°С – не более 1 мес.;

- приготовление отмывающего раствора: к 420 мл дистил­лированной воды добавить 30 мл концентрата отмываю­щего раствора, перемешать. Хранить при t= +2-8°С – не более 1 мес.;

- приготовление 10% раствора серной кислоты: к 22,5 мл дистиллированной воды добавить 2,5 мл концентриро­ванной серной кислоты, медленно влить кислоту в воду. Хранить при комнатной температуре не более 2 мес;

- приготовление субстратной смеси;

- приготовление 6 калибровочных проб: 2000, 1000, 500, 250, 100, 0 МЕ/мл. Развести калибраторы раствором для разведения образцов (титр разведения указан на флаконах и в инструкции). Хранить не более 0,5 ч при комнатной температуре.

 

Техника постановки анализа:

- перед исследованием набор и образцы выдержать при комнатной температуре не менее 30 мин.;

- образцы вносить в дубле;

- внести в первые 12 лунок по 100 мкл 6 калибраторов в дублях;

- внести в лунки для образцов по 90 мкл раствора для раз­ведения образцов и по 10 мкл анализируемых сывороток;

- инкубировать планшет 60 мин. при t= 37°С;

- промыть лунки не менее 4 раз промывочным раствором, просушить на фильтровальной бумаге;

- быстро внести в лунки по 100 мкл раствора конъюгата;

- инкубировать 30 мин. при t= 37°С;

- промыть планшет не менее 4 раз;

- быстро внести в лунки по 100 мкл свежеприготовленной субстратной смеси;

- инкубировать 10 мин. при комнатной температуре без перемешивания;

- внести в лунки по 100 мкл 10% H₂S0₄ (для остановки реакции);

- инкубировать 20-30 с на динамическом шейкере при ком­натной температуре.

Учет результатов. На спектрофотометре измерить оптическую плотность при 492 нм. При использовании про­граммы измерения на спектрофотометре можно получить ко­личественное содержание антител к тиреоглобулину. При отсутствии возможности получения количественного содер­жания антител строится калибровочная кривая и по ней оп­ределяется содержание ATв исследуемых образцах. Прин­цип построения калибровочной кривой подробно описан в предыдущих занятиях.

Контроль качества. На карте Шухарта откладыва­ются значения контрольной сыворотки при каждой поста­новке анализа.

 

 

Практическое занятие 10

Тема. Аллергодиагностика. Аллергены. Методы аллергологического тестирования. Иммунотерапия аллергенами.

План занятия:

1. Основные патогенетические звенья аллергического процесса

2. Лечебно-диагностические аллергены

3. Аллергологические методы

4. Оценка кожных проб

5. Механизмы ИТА

6. Осложения при ИТА

Методические указания к самостоятельной работе

По рекомендации ВОЗ (1998) в настоящее время считается корректным использование терминов «иммунотерапия аллергенами» (Allergenimmunotherapy) или «специфическая аллерговакцинация» (Therapeutic vaccines for allergic diseases) вместо устареших терминов «специфическая гипосенсибилизация» или «специфическая иммунотерапия». Понятие «десенситизация» используют для определения метода терапии, когда больным через определённые небольшие промежутки времени (как правило, через 15–30 мин) в течение нескольких часов вводят возрастающие (чаще всего двукратно) дозы АГ. Этот вариант десенсибилизации при отсутствии альтернативного антибактериального препарата применяют при аллергии на антибиотики пенициллинового ряда, а также у больных «аспириновой» БА.

    Впервые иммунотерапию пыльцевыми аллергенами для лечения больных полинозом применили в 1911 г. Нун и Фримен. Результаты первого контролируемого исследования эффективности иммунотерапии были опубликованы только в 1949 г. В 1998 г. Комитет экспертов ВОЗ опубликовал документ, в котором изложена позиция ВОЗ по ИТА. Эффективность ИТА доказана при АР, атопической БА и аллергии на яд перепончатокрылых.

В последние годы отмечается значительный рост числа аллергических заболеваний, что диктует необходимость постоянного поиска новых диагностических приемов, а также методов лечения аллергии. Диагноз «аллергия» ставится на основании физикальных, а также лабораторных, инструментальных и других методов общеклинического и аллергологического обследования.

Аллерген-специфическая иммунотерапия ведет свою историю с 1911 года, когда она была использована для лечения поллиноза (сезонного аллергического ринита). Целью лечения является снижение чувствительности пациента к естественной экспозиции данного аллергена — специфическая гипосенсибилизация. Именно под таким названием этот метод существовал долгое время. С накоплением сведений о том, что в основе лечебного действия этого метода лежат (преимущественно) иммунологические механизмы, его стали именовать специфической (аллерген-специфической) иммунотерапией. Поскольку введением аллергена достигается иммунологически (преимущественно) опосредованное повышение «устойчивости» к действию антигена (аллергена), то в этом было усмотрено сходство самой процедуры с вакцинацией, а аллергенных экстрактов — с вакцинами. Поэтому в настоящее время довольно часто вместо терминов «аллергенные экстракты» или «лечебные аллергены» стали использовать термин «аллергенные вакцины» («аллерговакцины»). Не вдаваясь в обсуждение оправданности и удачности подобных терминологических усовершенствований, эти сведения следует привести лишь для того, чтобы практический врач был осведомлен о смысле существующих терминов.

    Со времени появления аллерген-специфической гипосенсибилизирующей терапии (аллерген-специфической иммунотерапии – СИТ, иммунотерапия аллергенами – ИТА) накоплен огромный опыт клинического применения СИТ. Она стала одним из наиболее научно оправданных и широко используемых эффективных методов лечения аллергических заболеваний, в первую очередь тех, которые связаны с IgE-опосредованным механизмом аллергии.

Среди методов специфического аллергологического обследования особое место занимает так называемые провокационные тесты, направленные на выявление ответной реакции на специфический раздражитель – аллерген. Провокационные тесты с использованием аллергенов может проводить только специалист – аллерголог-иммунолог, владеющий практическими навыками проведения подобных исследований, способный быстро и грамотно провести лечебные мероприятия при возникновении системных реакций. Возможность развития системных реакций при проведении такого тестирования делает данную процедуру опасной, поэтому ее следует осуществлять только в условиях специализированного кабинета или стационара, оборудованных всем, что необходимо для купирования системных реакций. Провокационные тесты имеют свои показания и противопоказания, которые нужно учитывать при назначении подобных методов диагностики.

 Для проведения специфического провокационного тестирования используются стандартизированные лечебно-диагностические аллергены, прошедшие регистрацию в России и допущенные к применению. Основные группы лечебно-диагностических аллергенов, применяемых на данный момент в России для диагностики немедленной аллергии, следующие: пыльцевые аллергены; аллергены домашней и библиотечной пыли; аллергены клещей домашней пыли; аллергены эпидермиса животных; аллергены из пера и пуха птиц; пищевые аллергены; инсектные аллергены; бактериальные и грибковые аллергены.

Для аллерген-специфической диагностики и лечения использовали преимущественно препараты, получаемые экстракцией водно-солевым раствором активных действующих начал из различного сырья (растительного и животного происхождения), при контакте с которым возникают аллергические болезни и реакции. Такие водно-солевые экстракты помимо аллергенных содержат иные компоненты, которые отражаются на качестве препарата. Поэтому аллергенные препараты подвергают специальной очистке, методы которой все время совершенствуются.

Важнейшая проблема качества аллергенных препаратов, которая не решена до настоящего времени, заключается в их стандартизации. В разных странах существуют свои принципы и методы стандартизации аллергенов. Понятно, что при таком подходе невозможно сопоставить аллергенную активность препаратов разных производителей, а несовершенство идентификации самих аллергенных начал в препаратах затрудняет сопоставление аллергенной активности препаратов разных серий даже одного производителя. Поэтому в настоящее время формируется общая всемирная стратегия стандартизации аллергенных препаратов, предусматривающая обязательную стандартизацию аллергенов по следующим трем признакам:

• суммарная аллергенная активность;
• биологическая активность;
• содержание в препарате главных аллергенов в единице массы.

В европейских странах суммарная аллергенная активность препарата стандартизуется по степени вызываемой им кожной аллергической реакции (проба уколом) на чувствительных к данному аллергену пациентах, соотнесенной с кожной реакцией на гистамин. Состав аллергенного препарата характеризуют при помощи использования таких методов, как изоэлектрофокусирование, электрофорез в додецилсульфате натрия — полиакриламидном геле, IgE-иммуноблоттинг, перекрестный радиоиммуноэлектрофорез. IgE-связывающие свойства препарата оценивают в реакции торможения РАСТ (радиоаллергосорбентная техника). В настоящее время стало принципиально возможным для разных производителей определять содержание в препарате главных аллергенов, преимущественно ответственных за повышенную чувствительность организма к сложному по составу аллергену. Для этой цели в распоряжение разных стран передают международные референс-стандарты (ВОЗ), содержащие известные количества соответствующих аллергенов.

Новые технологии клонирования белковых молекул уже сейчас позволили получить многие важные аллергены (аллергены пыльцы растений, постельного клеща, эпидермиса некоторых животных, насекомых, ядов перепончатокрылых и пр.) в виде индивидуальных рекомбинантных белков, имеющих сравнимую аллергенную активность с соответствующими природными белковыми аллергенами. Такая новая технология облегчит стандартизацию аллергенных препаратов, позволив строго количественно определять главные аллергены в производственных сериях лекарственных форм.

Выпускаемые в настоящее время отечественными производителями диагностические и лечебные аллергены стандартизуют по содержанию в препарате единиц белкового азота, а их аллергенную активность устанавливают по результатам кожного тестирования на чувствительных к этому аллергену пациентах.

Основная цель провокационных тестов - выявить наличие гиперчувствительности к тому или иному аллергену, установить ее степень, а также подобрать спектр аллергенов для дальнейшего проведения аллерген-специфической иммунотерапии. При проведении тестирования производится нанесение на кожу или слизистые конъюнктив либо дыхательного тракта одного или нескольких разведений аллергена, после чего оценивается выраженность реакции в ответ на этот раздражитель.

Основные методы провокационного аллергологического тестирования:

- кожный (в том числе аппликационный);

- назальный;

- конъюнктивальный;

- ингаляционный;

- сублингвальный.

Кожное тестирование - наиболее доступный и высокоспецифичный метод выявления гиперчувствительности как немедленного, так и замедленного типа. Данный метод тестирования имеет противопоказания, которые также необходимо учитывать и при применении других провокационных тестов.

Противопоказания к проведению кожного тестирования: обострение основного заболевания; тяжелое, нескомпенсированное течение бронхиальной астмы; острые интеркуррентные инфекции (ОРЗ, ангина, пневмония и др.); декомпенсация заболеваний внутренних органов (печени, почек, сердечно-сосудистой системы, эндокринной системы, крови и др.); обострение очагов хронической инфекции. Активная фаза хронических инфекционных заболеваний (туберкулеза, сифилиса, бруцеллеза и др.); аутоиммунные заболевания (СКВ, склеродермия, ревматоидный артрит, дерматомиозит и др.); злокачественные новообразования; психические заболевания; беременность и лактация; синдром приобретенного иммунодефицита.

С целью диагностики одной из самых распространенных форм немедленной аллергии - атопии - применяют скарификационные и prick-методы кожного тестирования. Для диагностики гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) используют внутрикожные тесты с бактериальными и грибковыми аллергенами, для общей оценки ГЗТ возможно проведение кожных тестов с туберкулином и бруцеллином. Реакция оценивается через 24-48 ч. И в том и в другом случае используется тест-контрольная жидкость как отрицательный и раствор гистамина как положительный контроль.

Кожное тестирование может быть неинформативным (ложноположительные или ложноотрицательные результаты) по целому ряду причин - неправильное хранение аллергенов, снижение кожной реактивности, нарушения техники проведения кожного тестирования и др.

    Для того чтобы поставить заключительный диагноз, необходимо установить четкую связь между наличием данной сенсибилизации и клиническими проявлениями заболевания, т. е. подтвердить, что именно этот аллерген ответственен за появление симптомов аллергии.

    Для оценки степени чувствительности пациента к данному аллергену (а также с целью подбора начальной дозы лечебного аллергена для проведения аллерген-специфической иммунотерапии) проводится аллергометрическое титрование, т. е. тестирование с разными разведениями аллергена. Исследование осуществляют путем постановки кожных проб с различными разведениями аллергенов.

Кожные тесты можно проводить только с использованием специально разработанных диагностических аллергенов. Тесты с нанесением лекарственного препарата на кожу, внутрикожным или подкожным его введением с целью выявления лекарственной аллергии использовать не рекомендуется. Во-первых, это создает опасность возникновения системной реакции, а во-вторых, есть риск развития неспецифической местной воспалительной реакции, которая не может достоверно указывать на наличие или отсутствие аллергии.

    Методика постановки кожных аллергологических проб осуществляется следующим образом. На кожу предплечья, предварительно обработанную спиртом, наносят каплю тест-контрольной жидкости, каплю 0,01% раствора гистамина, а также каплю аллергена (аллергенов). Раствор с гистамином является положительным контролем, а с тест-жидкостью – отрицательным. Расстояние между местами нанесения капель не менее 2,5-3 см. После этого производится повреждение эпидермиса в области каждой капли. При этом используют разные скарификаторы. Скарификацию также можно выполнять ланцетами – специальными скарификаторами с фиксированными на них аллергенами. При проведении prick-тестирования повреждение наносится посредством укола, при проведении скарификации – поверхностной царапины эпидермиса (при проведении этой процедуры важно не повредить кровеносные сосуды!). Реакции оценивают через 10-20 мин. Оценка скарификационных и prick-тестов по степени выраженности реакции приведена в таблицах 1 и 2.

Таблица 10

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: