 |
Объекты и методы исследований
|
|
|
|
Объектом исследования являются чистые культуры микроорганизмов, выделенные из почв. В работе использовано 13 культур микроорганизмов, большинство из которых является Г+ спорообразующими аэробными палочками. Чистые культуры хранились в холодильнике в пробирках со скошенным питательном агаром. Перед началом исследований было произведено обновление штаммов, путем подращивания их на МПБ с последующим пересевом на ПА.
Методы исследований
Исследование физиолого-биохимических свойств
Для исследования физиолого-биохимических свойств микроорганизмов использовались дифференцировочные пластины. Пластина представляет собой панель с 20 конусообразными лунками, на дно которых нанесены соответствующие субстраты с индикаторами, стабилизированные поливиниловым спиртом. Панель закрывается крышкой. Панель и крышка изготовлены из полистирола. Субстрат с индикаторами вносят в лунки в жидком виде, затем высушивают и стерилизуют.
Специфическое действие препарата заключается в возможности дифференцировать бактерии на основе определения ферментативных систем по их действию на соответствующие субстраты.
Биохимические дифференцировочные пластины предназначены для определения ферментативной активности бактерий, выделяемых в ходе микробиологических исследований. Это может помочь при дальнейшей идентификации до рода и возможно вида.
Подготовка исследуемых образцов
Перед проведением исследования выделенные культуры подлежат изучению на чистоту.
Идентификацию культур, непосредственно из нативного материала, производят со скошенного мясо-пептонного агара (МПА). Используют культуры выращенных в течение 18–24 часов при температуре при температуре 37 оС, без предварительного подращивания их на МПБ (мясо-пептонном бульоне).
|
|
|
Если выделенная культура микроорганизма находилась какое-либо время на хранении при комнатной температуре или в холодильнике, производят предварительный посев ее на МПБ на 2–4 часа при температуре 37 оС, затеи осуществляют пересев культуры на скошенный МПА. Посевы инкубируют в течение 18–24 часов при температуре 37 оС.
Культуру с МПА используют для приготовления суспензии в стерильной 1% пептонной воде рH 7,2–7,4 и доводят мутность суспензии до 10 единиц по отраслевому стандартному образцу мутности бактериальных взвесей, стеклянному. При отсутствии отраслевого стандартного образца в 4,0 мл стерильной 1% пептонной воды вносят 2–3 петли исследуемой культуры до образования видимой мутности.
Проведение исследования
1. Вскрывают упаковку пластин.
2. Регистрируют на крышке панели номер засеваемого штамма.
3. Открывают крышку и располагают панель на столе.
4. Добавляют пипеткой по 0,15 мл микробной суспензии в стерильной 1% пептонной воде во все лунки панели, кроме 17,18,19 которые оставляют свободными.
5. Для создания анаэробных условий добавляют 1–2 капли стерильного вазелинового масла в лунки для определения аргининдегидрогеназы и уреазы (№№11,20).
6. Закрывают крышку панели.
7. Выдерживают пластины в течение 18–24 часов при температуре 37 оС.
Учет результатов
Учет результатов производят визуально в соответствии с цветовым указателем, приложенным к пластинам, 18–24 часа инкубации при 37 оС.
После окончания инкубации открывают крышку панели и в лунки для выявления ацетилметилкарбинола (№10) добавляют 1 каплю 6%-го раствора альфа нафтола и затем 1 каплю 40% раствора гидроокиси калия; для определения фосфатазы (№8) – 1 каплю 20% раствора гидроокиси натрия; для выявления нитратредуктазы (№9) добавляют 1 каплю реактива Грисса. Реакции учитывают немедленно в лунках №8,9, выявление ацетилметилкарбинола (№10) осуществляют через 15–20 минут после закапывания реактивов.
|
|
|
Определение способности роста на средах с добавлением поверхностно-активных веществ
Для определения способности роста на средах с добавлением различных ПАВ использовался чашечный метод. Производился глубинный посев по 1 мл бактериальной суспензии. Использовалось 2 среды: питательный агар и среда М9 (рецепты сред см. в приложении). В качестве селективных агентов использовались СМС на основе АПАВ и КПАВ, а также полиакриламид (ПАА) (НПАВ). ПАВ в количестве 1 мл вносились в среды перед стерилизацией (Турковская, 1997).
Определение активности
Определение способности штаммов подвергать деградации ПАВ определяли с помощью модифицированного нами метода лунок Турковской (Турковская, 1997,): в центре застывшей среды ПА/10 в чашках Петри стерильным пробочным сверлом вырезали лунку. Микроорганизмы высевались штрихом по радиусу от лунки к периферии чашки (посев производится секторами). Затем в лунку стерильно вносили исследуемое ПАВ. Контролем служили чашки с посевами без субстратов. Инкубирование проводили в термостате при 34 оС в течении 3 сут.
Результаты оцениваются через 2–3 суток. Отмечается рост от края чашки к центру, к лунке с ПАВ. Степень активности характеризуется количеством баллов по сравнению с контролем.
Материалы и оборудование
Культуры микроорганизмов, пробирки, колбы, чашки Петри, шпатели, штативы, предметные и покровные стекла, красители, спиртовка.
При любой микробиологической работе: при посевах, пересевах, выделении, сохранении чистых культур используются стерильные среды, стерильная посуда, стерильные инструменты, чтобы предотвратить возможность попадания посторонней микрофлоры. Посевы производятся в стерильных боксах.
Для обработки посуды применяется стерилизация сухим жаром. Она производится нагреванием в течении 2 часов, при температуре 170 0С в электросушильных шкафах.
Вся посуда перед стерилизацией должна быть вымыта, высушена и завернута в бумагу. Для заворачивания посуды используют газетную бумагу (которая не размокает).
Большинство питательных сред стерилизуют насыщенным паром под давлением в автоклавах. Повышение давления в автоклаве повышает температуру пара, образуемого внутри автоклава и, следовательно, температуру стерилизации (Теппер, 2004).
|
|
|
Среды. В работе использованы полноценные питательные среды: МПА, МПБ. В качестве селективной среды использовалась среда М9 (состав см. в приложении). В качестве селективных агентов использовались СМС на основе АПАВ и КПАВ, а также ПАА (НПАВ).
Экспериментальная часть
|
|
|
