Главная | Обратная связь | Поможем написать вашу работу!
МегаЛекции

Токсикокинетика. Метаболические маркеры.

Метаболомика находит применение при разработке анализов индивидуальной восприимчивости к лекарственным средствам, например, варфарину, при определении уровня проканцерогенов – полиароматических углеводородов

Получены сведения о многих метаболических маркерах, идентифицированных при исследовании мочи и других биологических жидкостей с помощью современных технологий. Например, при изучении в эксперименте токсичности HgCl2, а также наблюдали значительное повышение содержания янтарной, молочной и уксусной кислот и этанола. Изменение концентрации этанола связывают со снижением активности алкогольдегидрогеназы. Дифференцирующими метаболитами для определения степени токсического эффекта ртути являются валин, таурин, глюкоза и оксид триметиламина (ТМАО). Последний является общим биомаркером почечной токсичности и идентифицируется при действии других нефротоксикантов.

Важно отметить влияние кишечной микрофлоры на метаболические процессы. Кишечные бактерии обладают изменчивой восприимчивостью к лекарствам и токсикантам. Участие кишечной микрофлоры в синтезе метаболитов мочи зависит от их природы. Кишечные бактерии играют большую роль в метаболизме метиламина. Образование триметиламина (ТМА) из холина главным образом происходит с помощью кишечных бактерий, тогда как последующее окисление в ТМАО преимущественно происходит в печени. Образование ТМАО является примером сложных метаболических взаимодействий, которые должны рассматриваться с целью адекватной оценки результатов метаболомических анализов. У пациентов с хронической почечной недостаточностью часто происходит чрезмерно быстрый рост кишечных бактерий. Это способствует пониженному пищевому статусу больных, особенно нуждающихся в постоянном диализе. В организме повышаются уровни диметиламина (ДМА) и его канцерогенного метаболита — нитрозодиметиламина (НДМА). Следовательно, повышенный уровень ДМА и НДМА в моче может служить маркером действия почечного токсиканта. Однако различные почечные токсиканты по-разному влияют на рост кишечных бактерий, поэтому важно знать, как изучаемое соединение реагирует с кишечной флорой. Пока затруднительно ответить на вопрос, каким образом сопоставить уровень ДМА как маркера метаболической активности кишечных бактерий и уровень ДМА, зависящий от поступления холина из пищи и других источников, которые могут служить предшественниками синтеза метиламина.

Еще одним примером служит идентификация пироглутамата (5-оксопролина) как маркера токсического действия высоких доз парацетамола (Nацетил-п-аминофенола). Накопление пироглутамата, несомненно, связано с метаболизмом серосодержащих аминокислот, так как процесс может быть остановлен введением метионина, который опосредованно используется организмом как сульфатный и цистеиновый конъюгат парацетамола. В 1Н ЯМР-спектре мочи были обнаружены резонансные характеристики обоих конъюгатов, а также парацетамола глюкуронида. Таким образом, было показано, что 5-оксопролинурия является следствием недостаточного количества серосодержащих аминокислот и может служить биомаркером других химических агентов, которые снижают содержание серосодержащих аминокислот. Изучались образцы мочи людей, подвергавшихся хроническому производственному отравлению гептилом (ракетное горючее) в течение нескольких месяцев, с помощью системы ВЭЖХ-ЯМР. Результаты экспериментов показали повышение уровня 2-аминоадипата, β-аланина, цитруллина, N-α-ацетилцитруллина и аргининсукцината, что можно считать обнаружением биомаркеров токсического эффекта несимметричного диметилгидразина.

Исследователи отмечают встречающиеся противоречия в информации о биомаркерах (метаболитах токсикантов в моче), полученной за последние 10 лет с помощью новых технологий и ранее — традиционными методами.

Малотоксичные вещества могут вызывать временные нарушения метаболизма без нанесения большого вреда тканям и органам, но чувствительный прибор зафиксирует метаболический профиль, отличающийся от принятой нормы. Поэтому интерпретировать результаты анализа необходимо с учетом наиболее полной информации о пациенте.

Определение концентраций основных метаболитов является целью метаболических анализов, однако не менее важным и вполне информативным может быть изучение того или иного метаболита в условиях конкретного организма in vivo. Такие анализы включают использование прекурсоров, меченных изотопами, и исследование образцов определенных метаболитов, меченных изотопами. Соединения, похожие по структуре, но имеющие разный состав изотопов, называются изотопомерами. Использование стабильного изотопа 13С, принимая во внимание его распространенность в природе (всего 1,1%), обеспечивает надежность результатов анализа. Методом ЯМР-спектрометрии можно определить расположение изотопа в изучаемом соединении, так как каждый изотопомер показывает определенный ЯМР-спектр Определение состава изотопомера возможно с помощью как прямой одномерной, так и двумерной 13С ЯМР-спектрометрии, чаще применяется вариант 2D ЯМР-методов HSQC.

Для изучения метаболизма дейтерированных субстратов применяют 2D ЯМР. Положительная сторона этого подхода заключается в относительной легкости проведения исследований и низкого распространения дейтерия в природе по сравнению, например, с 13С. Метод 2D ЯМР использовали для изучения печеночного метаболизма. Так, при исследовании метаболизма L- и D-[метил-2Н3]метионина ([метил-D3] метионина) с помощью 2D ЯМР in vivo можно проследить биотрансформацию того или иного изомера, используя специальную поверхностную спираль, помещенную на печень анестезированных крыс. Например, была обнаружена реакция трансметилирования, приводящая к образованию [метил-D3]саркозина, что позволило определить активность метионинаденозилтрансферазы и глицин-N-метилтрансферазы.

В течение времени некоторые другие метаболиты также становятся дейтерированными из-за действия ферментов, вовлеченных в процессы метаболизма. Одни из дейтерированных саркозинов окисляются в митохондриях с помощью саркозиндегидрогеназы, в конечном счете превращаясь в дейтерированную воду, однако некоторое количество может экскретироваться. Интересно, что аналогичные исследования, в которых использован прекурсор дейтерированного D-метионина, дали по существу такие же результаты, показывающие быстрое превращение D- в L-изомер. Сравнение метаболизма L- и D-[метил-D3]метионина показало, что результаты могут меняться под воздействием бензоата натрия, ингибитора D-аминооксидазы. Преобразование D-метионина в L-метионин, в котором участвует этот фермент, сопровождается обратным аминированием, которое катализируется ферментом глутаминазой II. Было отмечено уменьшение количества L- метионина при введении бензоатов, что, возможно, связано со снижением уровня глицина, так как последний используется в этом случае для образования гиппурата из бензоата. Снижение уровня глицина уменьшает его активность в реакции образования глицин-N- метилтрансферазы, что опосредованно ведет к уменьшению количества L-метионина. Обнаруженные in vivo с использованием метода поверхностной спирали дейтерированные метаболиты печени были определены и в моче с помощью 2D ЯМР. Применяя указанную выше технологию, можно исследовать эффекты специфических химических веществ в метаболических путях.

Следует еще раз обратить внимание на то, что классический аналитический подход к определению содержания метаболитов в биологических системах с использованием внутренних стандартов и построением калибровочных графиков практически неприменим для полных исследований сложных метаболомов. Автоматический анализ данных при определении метаболических характеристик возможен с помощью специальных опознавательных компьютерных программ, коррелирующих результаты исследований многоаспектного набора данных (например, значения хроматографических времен удерживания, интенсивности масс- и ЯМР-спектров). Масштабы сокращения времени получения массива данных огромны. С помощью метода ВЭЖХ-ЯМР-МС-TоF в течение 20 мин (со скоростью 5 спектров/c) можно создать 6000 характерных МС- и ЯМР-спектров, каждый из которых включает более 50000 точек.

Задача состоит в том, чтобы выделить все реальные масс-спектральные и ЯМР-характеристики для более 1000 потенциальных метаболитов, разделенных хроматографически (т.е. в каждой хроматограмме).

Одним из способов визуализации и анализа данных является создание контурных графиков, на осях которых указаны аналитические сигналы методов. Различия в контурах от образца к образцу отражают изменения в метаболических путях. При этом необходимо иметь информацию о том, какому (острому или хроническому) воздействию токсиканта подвергся обследуемый. В некоторых случаях краткосрочные изменения метаболизма при остром отравлении могут быть противоположны этим же изменениям, наблюдаемым у пациента при длительном воздействии токсиканта.

В клинической диагностике метаболических изменений применение комплекса ВЭЖХ-ЯМРМС позволило определить липопротеины плазмы крови. Методом ЯМР-спектрометрии получили индивидуальную характеристику каждого липопротеина, согласно их разделению на липопротеины высокой плотности, липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и липопротеины очень низкой плоскости, имеющих небольшое различие между собой, заключающиеся в разном диаметре фосфолипидного слоя в оболочках липопротеинов, что позволяет безошибочно диагностировать и прогнозировать течение коронарных заболеваний. Результаты этих исследований были полезны при определении механизма повреждающего действия токсикантов, оказывающих влияние на метаболизм липопротеинов, мобилизацию гликогена, стадии глюкогенеза и другие процессы, происходящие в организме в режиме реального времени. Несмотря на многие вопросы, еще требующие ответа исследователей, и несовершенство аналитических технологий, метабономический анализ произвел революционный прорыв в токсикологии и фармакологии.

 

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Процессами метаболизма клеток управляет сложная сеть молекулярных взаимодействий, определяющая уровни экспрессии различных генов. Изучение динамики метаболических процессов, происходящих в клетке, и природы метаболитов является частью исследования структурной организации сетей метаболических потоков и основой выявления принципов их регуляции.

Технологии метаболомики и метабономики, в частности использование аналитических систем ВЭЖХ-МС-ЯМР, позволяют определить интерактивную природу клеточных реакций на химические агенты и опасность развития нежелательных побочных эффектов лекарственной терапии в зависимости от индивидуального гено- и фенотипа.


 

ЛИТЕРАТУРА:

1. Nicholson et al., 1985; Chace et al., 2001, 2002; Pitt et al., 2002; Han et al., 2003.

2. McGehee et al., 1994; Waters et al., 2002

3. GonzalezSastre et al., 1988; Espina et al., 2001.

4. Jeffrey et al., 2002; Xu et al., 2002.

5. A.W. Nicholls et al., 2001

6. Burgess et al., 2001; Jeffrey et al., 2002.

7. London, Gabel, 1988; Farran et al., 1993; Akira et al.,1994; Jones et al., 2001.

8. Osborne et al., 2000; Shockcor, Holmes, 2002; Sim et al., 2002; Watkins et al., 2002

9. Tate et al., 2001; Seshadri et al., 2002; Shi et al., 2002; Selman et al., 2006; Wang et al.,

2007; Rezzy et al., 2009

Поделиться:





Воспользуйтесь поиском по сайту:



©2015 - 2024 megalektsii.ru Все авторские права принадлежат авторам лекционных материалов. Обратная связь с нами...