 |
Самостоятельная и лабораторная работа
|
|
|
|
ТЕМА: ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ (КУЛЬТУРАЛЬНЫЙ) МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ.
ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ
1. Питание бактерий. Питательные вещества – источники углерода и азота. Классификация бактерий по типам питания Аутотрофы и хемоорганотрофы
2. Факторы роста и их источники. Источники минеральных элементов.
3. Способы и механизмы переноса питательных веществ через мембрану.
4. Энергетические потребности бактерий. Пути получения энергии у аутотрофов (фотосинтез, хемосинтез). Источники и пути получения энергии у хемоорганотрофов.
5. Аэробный и анаэробный типы биологического окисления у бактерий. Аэробные, анаэробные, факультативно анаэробные и микроаэрофильные бактерии. Способы создания анаэробных условий.
6. Задачи, этапы, преимущества и недостатки бактериологического (культурального) метода исследования.
7. Рост и размножение микроорганизмов. Способы размножения. Бинарное (простое) деление, механизм. Размножение бактериальных популяций.
8. Принципы и методы культивирования бактерий. Питательные потребности микробов.
9. Питательные среды для культивирования бактерий. Требования к питательным средам. Классификация питательных сред.
10. Условия и техника культивирования бактерий. Техника посева на питательные среды. Закономерности и характер роста бактерий на плотных и жидких питательных средах.
11. Способы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий.
12. Свойства, используемые для идентификации выделенных культур.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ И ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
Бактериологический метод (этапы):
1► 1-й этап выделения чистой культуры аэробных бактерий: А) Микроскопия патологического материала.
|
|
|
Окраска мазков из патологического материала по Граму. Зарисовка препарата.
| Мазок из патологического материала Окраска по Граму Увеличение 7х90=630 раз |
Б) Освоение под руководством преподавателя техники посева патологического материала бактериологической петлей и шпателем на пластинчатые питательные среды.
Посев патологического материала бактериологической петлей на пластинчатый мясопептонный агар (МПА) для получения изолированных колоний.
Классификация питательных сред (указать области применения)
1. По консистенции: жидкие (мясо- пептонный бульон, желчный, сахарный бульон), плотные (2- 3% агара) и полужидкие (0,15- 0,7 % агара) среды.
2. По происхождению: естественные - из молока, мяса. яиц, картофеля, сыворотки крови человека, животных и др продуктов; искусственные – 1) натуральные сбалансированные смеси питательных веществ в концентрациях и сочетаниях, необходимых для роста и размножения микроорганизмов, универсальный источник азота и углерода - пептоны - продукты неполного расщепления белков с помощью пепсина или различные гидролизаты (рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.).2) синтетические c точным химическим составом Сотона для микобактерий, 199 для клеток.
3. По составу: простые питательные среды (мясо- пептонный бульон- МПБ, мясо- пептонный агар- МПА) и сложные (КА = МПА +5- 10% крови животных)
4. По назначению:
А) Общего назначения - универсальные, предназначенные для культивирования любых микроорганизмов (МПА,КА)
Б ) Специальные для выращивания микроорганизмов не растущих на универсальных средах, дифференциации видов и избирательного выделения отдельных видов микроорганизмов:
- элективные (селективные) для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующих – (солевой агар для стафилококков).
· дифференциально-диагностические (ДДС) - среды, позволяющие различать виды бактерий по ферментативной активности; Они содержат: 1) универсальную питательную среду (МПА, КА); 2)дифферецирующий фактор - химический субстрат (например, углевод), различное отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроба.3) Индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о биохимической реакции. (среды Эндо, Плоскирева, Гисса и другие).
|
|
|
· дифференциально-селективные (ДС) - среды, позволяющие выделять бактерии определенного вида по их физиологическим особенностям и дифференцировать от других видов по ферментативной активности Они содержат: 1) МПА 2) элективный химический субстрат, препятствующий росту других видов бактерий. 3)дифферецирующий фактор - субстрат, отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроба;) 4.) Индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о биохимической реакции. (среды ЖСА для стафилококков, ВСА для сальмонелл, Плоскирева для шигелл и сальмонелл).
В) Обогащения среды для размножения и накопления бактерий определенного вида в клиническом материале (кровь в 20% желчном бульоне =сальмонеллы, отделяемое зева в 10 % сывороточном+ 2 % теллурита = коринебактерии.)
Г) Транспортные среды для забора и доставки (консервации) клинического материала =48 часов (Среда Амиеса –полужидкий агар+уголь активированный).)
Питательные среды (примеры):
Среда Эндо Тип среды дифференциально-диагностическая для энтеробактерий Питательная основа МПА Дифференцирующий фактор лактоза 1% Индикатор основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Е.сoli разлагают лактозу до кислоты –колонии красные с металлическим блеском, патогенные бесцветные;
Солевой агар Тип среды элективная для выделения стафилококков Питательная основа МПА Элективный фактор хлористый натрий 10%
Среда Плоскирева Тип среды дифференциально-селективная для энтеробактерий
Питательная основа МПА Элективный фактор соли желчных кислот Дифференцирующий фактор лактоза
Индикатор нейтральный красный
Желточно-солевой агар Тип среды дифференциально-селективная для S. aureus _
Питательная основа МПА Элективный фактор хлористый натрий 10%
|
|
|
Дифференцирующий фактор яичный желток
Индикатор нет
2► 2 этап бактериологического метода исследования (выделение чистой культуры):
А) Изучение изолированных колоний (эшерихий, стафилококка) на пластинчатом МПА.
| Изучаемые культуральные свойства | 1 тип колоний | 2 тип колоний |
| - форма колонии | Правильной формы, круглые | Правильной формы |
| - консистенция | однородные | однородные |
| - размер колонии | средние (размером 2-4 мм) | Крупные, |
| - цвет | белые | серые |
| - характер края | с ровными краями | с ровными краями |
| - характер поверхности | выпуклые | плоские |
Б) Приготовление мазков из отобранных колоний (окраска по Граму).
2. Морфология микроорганизмов из изолированных колоний(окраска по Граму)
|
В) Пересев изолированных колоний на скошенный МПА для накопления чистой культуры.
3► Выделение чистой культуры анаэробных бактерий: посев суспензии почвы на среду Китта-Тароцци для выделения патогенных клостридий
Среда Китт— Тароцци состоит из питательного бульона, 0,5% глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для поглощения кислорода из среды. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 20 — 30 минут для удаления воздуха из среды. После посева питательную среду сразу заливают слоем парафина или вазелинового масла для изоляции от доступа кислорода.
Методы создания анаэробиоза:
1. Физический- откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (чаще- N2- 85%, CO2- 10%, H2- 5%), предварительное кипячение питательных сред, посев в глубокий столбик агара, заливка сред вазелиновым маслом для сокращения доступа кислорода, использование герметически закрывающихся флаконов и пробирок, шприцев и лабораторной посуды с инертным газом, использование плотно закрывающихся эксикаторов с горящей свечой
2. Химический- применяют химические поглотители кислорода.
3. Биологический - совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов (аэробы поглощают кислород и создают условия для размножения анаэробов – метод Фортнера).
|
|
|
Среда Китт — Тароцци состоит из питательного бульона, 0,5 % глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для поглощения кислорода из среды. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 20 — 30 минут для удаления воздуха из среды. После посева питательную среду сразу заливают слоем парафина или вазелинового масла для изоляции от доступа кислорода.
4. Смешанный - используют несколько разных подходов.
Используются специальные приборы для создания анаэробных условий - анаэростаты. В настоящее время наиболее простым и эффективным оборудованием для создания анаэробных и микроаэрофильных условий является химический метод со специальными пакетами, действующими по принципу поглощения атмосферного кислорода в герметически закрытых емкостях.
Среда Вильсона-Блера (пробирки,чашки):
Питательная основа МПА Дыхательный субстрат глюкоза
Редуцирующий фактор сульфит натрия и двуххлористое железо сульфит-натрия Na2SO3 →Na2S
Для среды Вильсона — Блера базой является агар с добавлением глюкозы, Клостридии образуют на этой среде колонии чёрного цвета за счет восстановления сульфита до сульфид — аниона, который соединяясь с катионами железа (II) дает соль чёрного цвета. Как правило, черные на этой среде образования колонии, появляются в глубине агарового столбика.
Тиогликолевая среда (среда для контроля стерильности): (пробирки):
Питательная основа МПБ Дыхательный субстрат глюкоза Редуцирующий фактор тиогликолят натрия
Индикатор резазурин
Глюкозо-кровяной агар Цейсслера: (чашки): Питательная основа МПА, кровь
Дыхательный субстрат глюкоза Редуцирующий фактор гемоглобин
|
|
|
