Главная | Обратная связь | Поможем написать вашу работу!

Условия для выделения колоний

Условия для получения суспензии клеток

Операция	Среда	Термостатирование	Центрифугирование
Температура,ºС	Продоолжительность,ч	Частота вращения центрифуги, с^-1	Продолжительность, мин
Получение культуры	Гидролизованное молоко с 2,5 % дрожжевого автолизата	25 или 30	17-18	-	-
Наращивание клеток на плотной питательной среде	Агар с гидролизованным молоком или 2,5 % дрожжевого автолизата	25 или 30	17-18	-	-
Очистка клеток	Дистиллированная вода	-	-	313-523	10-15

При комбинированном воздействии этиленимина и ультрафиолетовых лучей вначале суспензию клеток подвергают действию этиленимина, а затем ультрафиолетовых лучей. Раствор этиленимина готовят на дистиллированной воде перед использованием. Для этого содержимое ампулы (0,1 мл) переносят в стерильную мерную колбу на 200 мл, добавляя дистиллированную воду до метки. Этот раствор имеет концентрацию 1:2000. Затем в стерильную пробирку отбирают 0,65 мл раствора этиленимина, 1,35 мл стерильной дистиллированной воды и 8 мл суспензии клеток. Получают концентрацию этиленимина в смеси 0,033 %. Смесь помещают в термостат, где выдерживают определенное время (табл.2).

Таблица 2

Режимы воздействия мутагенов на L.lactis

Операция	Концентрация мутагена, %	Термостатирование	Центрифугирование	Продолжительность облучения УФ-лучами, с
Температура, ºС	Продолжительность, мин	Частота вращения центрифуги, с^-1	Продолжительность, мин
Воздействие этиленимина на суспензию клеток	0,033			-	-	-
Облучение суспензии клеток	-	-	-	-	-	15-45
Реактивация	-	18-22*		-	-	-
Воздействие N-нитрозоэтилмочевины		25 или 30	30-60	-	-	-
Снятие остаточного действия	-	-	-		10-15	-
Подращивание клеток	-	25 или 30		-	-	-

*Возможна выдержка при комнатной температуре на качалке.

Для снятия остаточного действия этиленимина смесь центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, клетки встряхивают и добавляют дистиллированную воду (10 мл). После перемешивания смесь помещают в чашки Петри (по 5 мл), которые устанавливают в бокс, где их открывают и облучают ультрафиолетовыми лучами (лампой БУВ-15 на расстоянии 30 см в течение 15-45 с). При облучении содержимое чашки перемешивают равномерным вращательным движением. Чашки с облученной суспензией закрывают светонепроницаемой бумагой и оставляют на 1 ч при комнатной температуре.

ют при оптимальной температуре роста в течение 17—18 ч. Получен* ную культуру наносят на скошенную плотную питательную среду, посевы термостатируют при оптимальной температуре. После этого клетки смывают с поверхности среды стерильным физиологическим раствором. Суспензию клеток помещают в стерильные центрифужные стаканчики (пробирки), которые закрывают полиэтиленовой пленкой, закрепляя ее резинкой. Стаканчики (пробирки) центрифугируют, сливают надосадочную жидкость, встряхивают осадок, добавляют стерильную дистиллированную воду и вновь центрифугируют. Такую операцию повторяют 2 раза. В результате получают клетки, отмытые от остатков среды. Из отмытых клеток в стерильной дистиллированной воде готовят суспензию клеток, содержащую от 500 до 1000 тыс. клеток в 1 мл по стандарту мутности. Предварительно проверяют совпадаемость содержания клеток по стандарту мутности с данными, полученными при посеве на плотную питательную среду.

11ри комбинированном воздействии этиленимина и ультрафиоле- гоиых лучей вначале суспензию клеток подвергают действию этилен- нмина, а затем ультрафиолетовых лучей. Раствор этиленимина гото- иill на дистиллированной воде перед использованием. Для этого (одержимое ампулы (0,1 мл) переносят в стерильную мерную колбу мн 200 мл, добавляя дистиллированную воду до метки. Этот рас- 1ми|> имеет концентрацию 1:2000. Затем в стерильную пробирку н|Пи|шют 0,65 мл раствора этиленимина, 1,35 мл стерильной дистнл- Лнжпн110й воды и 8 мл суспензии клеток. Получают концентрацию *I н 'ii'iiitMiiiia в смеси 0,033%. Смесь помещают в термостат, где вы- н |. I 11 п л ют определенное время (табл. 63). Дли снятия остаточного действия этиленимина смесь центрифу-

По окончании выдержки делают глубинный или поверхностный посев суспензии клеток на плотную питательную среду. Разведение суспензии берут из расчета, чтобы на чашке выросло 10-20 колоний. Чашки с посевами выдерживают в термостате при оптимальной температуре в течение 3 сут, а затем дополнительно 1-2 сут при комнатной температуре.

От каждого штамма выделяют не менее 50-100 колоний (вариантов) в стерильное обезжиренное молоко, термостатируют при оптимальной температуре роста и отбирают вариант, свертывающие молоко не более чем за 24 ч, остальные отбраковывают. Отобранные варианты перевивают петлей в стерильное обезжиренное молоко 5-7 раз через 20-30 дней. При этом отбирают все варианты, свертывающие молоко не более 17 ч. Режим выделения и отбор вариантов после воздействия мутагенов приведены в табл. 3.

Таблица 3

Условия для выделения колоний

Операция	Среда	Термостатирование	Количество колоний или вариантов на одной чашке Петри
Температура, ºС	Продолжительность, ч
Посев суспензии после воздействия и термостатирования	Агар с гидролизованным молоком и 2,5 %	25 или 30		20-30
Выделение колоний, термостатирование	Обезжиренное молоко	25 или 30		50-100
Пересадка вариантов (5-7 раз)	То же	25 или 30		-
Отбор вариантов	То же	25 или 30		-

У наиболее активных вариантов (свертывающих молоко до 17 ч) проверяют продолжительность свертывания пастеризованного молока и органолептические показатели по сравнению с исходным штаммом (при внесении 3% культуры). Отбирают варианты, свертывающие молоко не менее чем на 30% быстрее исходного штамма, образующие в молоке плотный колющийся сгусток и чистый кисломолочный вкус. После 2—3 пересадок в стерильное обезжиренное молоко варианты вновь проверяют на длительность свертывания пастеризованного мо лока и органолептические показатели по сравнению с исходным штаммом. Такой отбор проводят 2—3 раза. Этиленимин является производным иприта, легко воспламеняющимся веществом. Поэтому при-работе с этиленимином необходимо пользоваться защитными очками, резиновыми перчатками и смоченной водой марлевой повязкой (последняя только при вскрытии ампулы и приготовлении раствора этиленимина). Вся работа по вскрытию ампулы, приготовлению раствора этиленимина и посеву проводится без спиртовки или газовой горелки в настольном боксе, предварительно облученном бактерицидной лампой. При работе с УФ-лучами работают в защитных очках и резиновых перчатках. Бокс при обработке бактерицидной лампой и облучении УФ-лучами суспензии клеток должен быть защищен от действия дневного света. Для чтого стенки и крышку бокса закрывают светонепроницаемой бумагой или белой тканью.

Этиленимин является производным иприта, легко воспламеняющимся веществом. Поэтому при работе с этиленимином необходимо пользоваться защитными очками, резиновыми перчатками и смоченной водой марлевой повязкой (последняя только при вскрытии ампулы и приготовлении раствора этиленимина). Вся работа по вскрытию ампулы, приготовлению раствора этиленимина и посеву проводится без спиртовки или газовой горелки в настольном боксе, предварительно облученном бактерицидной лампой. При работе с УФ-лучами работают в защитных очках и резиновых перчатках. Бокс при обработке бактерицидной лампой и облучении УФ-лучами суспензии клеток должен быть защищен от действия дневного света. Для этого стенки и крышку бокса закрывают светонепроницаемой бумагой или белой тканью.

Воздействие N-нитрозоэтилмочевины (НЭМ) на штаммы L.lactis. Отобранные штаммы L.lactis (17-18 ч на стерильном обезжиренном молоке) засевают в пробирки с гидролизованным молоком, содержащим дрожжевой автолизат, термостатируют при оптимальной температуре роста 17-18 ч. Затем в колбочку с той же средой вносят I |% культуры и термостатируют при оптимальной температуре для развития клеток (культуры) в средней фазе логарифмического роста| и содержания сотен миллионов клеток в 1 мл.

Культуральную жидкость центрифугируют в стерильных центрифужных стаканчиках, после чего сливают надосадочную жидкость. Бактериальные клетки встряхивают, добавляют стерильную дистиллированную воду и вновь центрифугируют. Такую операцию повторяют дважды.

Отмытые клетки ресуспендируют в 1%-ном буферном растворе pH 6,0 (Na₂HP0₄ и КН₂РО₄) N-нитрозоэтилмочевины (НЭМ). Суспензию клеток готовят так, чтобы их содержание в 1 мл было равно 500-1000 клеток. Среды, режимы термостатирования и центрифугирования приведены в табл.4.

Таблица 4

Воспользуйтесь поиском по сайту: