Вещества, содержащиеся в слюне пиявок

 

3.1.1 Антигемостатики

Они препятствуют развитию механизмов свертывания крови, чем обеспечивают свободное истечение кропи из поврежденных сосудов во время всего периода питания пиявки. Антигемостатики начинают выделяться с момента разрушения микрососудов и появления крови в ранке, поэтому они обнаруживаются в средней фракции слюны.

Следует отметить, что в составе секрета слюны пиявки обнаружены вещества, блокирующие все основные механизмы активации системы свертывания крови (первичный и вторичный) К числу соединений этой группы следует отнести следующие:

Калин — ингибитор адгезии и агрегации тромбоцитов, а также активации фактора Виллебранда. Впервые описан R. Munro и соавторами в 1991 году и имеет молекулярную массу в 65 кДа.

Апираза — ингибитор агрегации тромбоцитов инициированной АДФ. Впервые выделена в 1987 году М. Rigbi и соавторами. Описаны две ее изоформы — низко- и высо комолекулярная (45 и более 400 кДа соответственно). Наибольшая активность при рН 7,5. Апираза вызывает гидролиз аденозиновых нуклеотидов (АТФ и АДФ), причем с примерно равной начальной скоростью.

Антагонист PAF (фактора активации тромбоцитов) — препятствует адгезии и активации тромбоцитов, миграции тромбоцитов и нейтрофилов в очаг поражения, а также сокращению гладкомышечных клеток. PAF представляет собой фосфоглицерид, выделяемый в процессе иммунологических реакций нейтрофилами, базофилами и макрофагами, а также в процессе специфической активации тромбоцитов. PAF является мощным медиатором воспаления и, выделяясь в области нанесения ран, инициирует гемостаз и воспалительную реакцию. Антагонист PAF впервые описали М. Orevu и соавторы (1992).

Ингибитор Ха фактора (FXaI — Factor Ха Inhibitor) — в каскаде белков плазменного гемостаза фактор Ха является ферментом, катализирующим превращение протромбина в тромбин в присутствии ионов Са²⁺, фактора свертывания крови V на поверхности мембран активированных тромбоцитов или фрагментов разрушенных эндотелиальных гладкомышечных клеток (иногда фактор Ха называют протромбиназой). FXaI первые выделили из разбавленной| слюны медицинской пиявки в 1988 году М. Rigbi и соавторы. Получен и рекомбинантный (искусственный) FxaI, который, как показали опыты на экспериментальных животных, оказывает защитное действие против венозного тромбообразования.

Гирудин — другой полезный фермент, своего рода специфический ингибитор фермента тромбина. Его выделил из экстракта пиявок в 1884 году Хайкрафт. Это вещество замечательно тем, что оно замедляет свертывание крови. Гирудин — уникальный высокоспецифичный ингибитор фермента тромбина, с которым он образует прочный комплекс, тем самым блокирует все известные реакции, активатором в которых выступает тромбин:

- активацию фибриногена и превращение его в нерастворимый фибриновый сгусток;

- регуляцию V, VIII, XIII факторов   свертывания;

- регуляцию компонентов системы комплемента

- изменение функционального состоянии клеток крови (моноцитов, нейтрофилов), в том числе и агрегацию тромбоцитов;

- изменение состояния эндотелиальных и гладкомышечных клеток кровеносных сосудов.

В настоящее время строение и механизм действия гирудина изучены достаточно подробно. Гирудин имеет у пиявки более чем 20 изоформ, различающихся длиной полипептидной цепи и наличием или отсутствием некоторых аминокислотных остатков. Третичная структура ингибитора представлена тремя образованиями: компактным доменом (6~39(в зависимости от изоформы) аминокислотных остатков) вблизи N-конца, образующим так называемое «ядро»; подвижными относительно ядра коротким пептидом (1~5 аминокислотных остатков) и длинным С-концевым хвостовым доменом (40~65(в зависимости от изоформы) аминокислотных остатков). Методами генной инженерии получен рекомбинантный гирудин и фармацевтический препарат на его основе.

Гирудин взаимодействует с тромбином, блокирует два участка его активного центра. Тем самым блокируется доступ субстратов и, в частности фибриногена, к ферменту. За счет большого количества контактов между тромбином и гирудином образующийся комплекс исключительно прочен (константа диссоциации K_d =10^{-14 М). Сродство этих веществ столь высоко, что гирудин ингибирует не только свободный тромбин, но и фермент, связанный с фибриновым сгустком.}

 В 1940-х годах А.В. Кирсанов и М.Н. Быстрицкая получили препарат гирудина-сырца. Очищенный гирудин был впервые выделен Ф. Марквардтом на основе разработанного им метода фракционирования экстракта из головной области медицинской пиявки. Исключительно высокая специфичность гирудина по отношению к тромбину выгодно отличает его от других природных ингибиторов этого фермента: антитромбина 3, гепарина и ά₂-макроглобулина. По сравнению с рядом синтетических ингибиторов тромбина гирудин представляет собой идеальный ингибитор этого фермента.[3], [11]

Ингибирование активности тромбина, которое проявляется в замедлении или полном блокировании свертывания фибриногена, — не единственная функция гирудина. В его присутствии замедляется реакция активации тромбином факторов свертывания V, VIII, XIII. Гирудин препятствует реакции высвобождения и агрегации тромбоцитов, ингибируя связывание тромбина кровяными пластинками. Он вызывает диссоциацию комплекса тромбина со специфическими белками — рецепторами на тромбоцитах, так как у тромбина сродство к гирудину выше, чем к высокоаффинным рецепторам на тромбоцитах. Гирудин лишает тромбин способности повышать антикоагуляционный и фибринолитический потенциалы крови при внутривенном введении крысам.

Препараты гирудина не токсичны. При внутривенном или подкожном введении растворов этого вещества в дозах, которые значительно превышают терапевтические, никаких местных или общих явлений отравления или других негативных последствий не наблюдается. Однако частично очищенный гирудин вызывает некоторые побочные реакции, например, нарушение сердечной деятельности, дыхания.

Изучением фармакологических и антитромботических свойств гирудина на животных занимался Ф. Марквардт. Для внутривенного введения он использовал высокоочищенный и частично очищенный препараты гирудина. При введении собакам высокоочищенного гирудина частота сердцебиений, ритмика дыхания, артериальное давление в правом и левом желудочках не изменялись. Частично очищенный препарат гирудина вызывал понижение этих показателей. Нормализация деятельности этих систем происходила спустя 60 - 90 минут после внутривенного введения исследуемого препарата. Использование высокоочищенного гирудина не вызывало изменений числа тромбоцитов, уровня фибриногена и гемоглобина крови.[8]

После введения высокоочищенного гирудина животным концентрация его снижалась на 50%. У собак это происходило на 51-й минуте, у кроликов — на 62-й и у крыс — на 66-й. Через час 70% гирудина в биологически активной форме содержалось в моче животных. Полное выведение гирудина с мочой отмечалось через 3 часа. При введении животным гирудин удлиняет общее время свертывания крови, тромбиновое и частичное тромбопластиновое время плазмы крови. Внутривенное введение крысам препаратов гирудина в дозах 2000 и 10 000 ATNIH Ед/кг массы тела полностью блокировало образование тромбов в изолированном участке яремной вены.[2]

Экспериментальные исследования на крысах выявили следующие любопытные факты. Тромбообразование в опытах стимулировали внутривенным введением активированной стеклом сыворотки крови через 10 минут после инъекцирования гирудина. 60-минутный интервал между введением гирудина и сыворотки приводил к блокированию тромбообразования только при использовании высоких доз гирудина (10 000 ATU/кг). Гирудин предупреждал образование микротромбов при диссеминированном внутрисосудистом свертывании крови (ДВС синдром), стимулированном введением животным эндотоксина, препятствовал тромбообразованию, которое было вызвано летальными дозами тромбина. Эти свойства гирудина делают его перспективным для лечения сердечнососудистых заболеваний. Трудности получения этого препарата из пиявок в достаточных количествах препятствуют его широкому использованию в медицине. В настоящее время делаются попытки получения гирудина методами генной инженерии и уже проводятся клинико-фармакологические испытания высокоочищенных препаратов гирудина. При внутривенном или подкожном одноразовом введении гирудина здоровым людям (в дозе 1000 ATU/кг) 50% ингибитора через 24 часа выводится с мочой в активной форме. Наблюдается удлинение тромбинового, частичного тромбопластинового и протромбинового времени плазмы крови. Эти показатели системы свертывания крови нормализуются по мере выведения гирудина из организма. Количество тромбоцитов, уровень фибриногена и фибринолитическая активность плазмы не изменяются. Не отмечено влияния гирудина на кровяное давление, частоту сердцебиений и дыхания.

 

Литические соединения.

Они обеспечивают проникновение веществ слюны, разрушение тканей жертвы, расширение раны, расплавление микрососудов. Кроме того, литические соединения влияют на проницаемость межклеточного матрикса дермы.

Гиалуронидаза - фермент, катализирующий реакции гидролитического расщепления и деполимеризации гиалуроновой кислоты и родственных ей соединений кислых мукополисахаридов. Этот фермент широко распространен в живой природе: в ядах змей и пауков, экстрактах семенников человека, у некоторых бактерий, в экстрактах пиявок. Гиалуронидаза определяет приспособительную особенность пиявок к питанию кровью. Гиалуронидаза облегчает проникновение в организм веществ в результате расщепления гиалуроновой кислоты — одного из компонентов основного вещества соединительной ткани. Полимеры гиалуроновой кислоты играют роль цементирующего агента, который скрепляет отдельные тканевые элементы и клетки. Можно предположить, что гиалуронидаза - вещество, с помощью которого другие биологически активные вещества, входящие в состав слюны медицинских пиявок, проникают в организм хозяина при насасывании крови пиявкой.

Учитывая, что гликозоаминогликаны гиалуроновой кислоты входят в состав базальной мембраны (на которой расположены клетки зародышевого слоя эпидермиса), межклеточного матрикса, а также базальных мембран капилляров, она играет большую роль не только как фактор проникновения, но и в возникновении последующих физиологических реакций. Следует отметить, что в составе слюны пиявки обнаружены две гиалуронидазы. Они отличаются по способности воздействовать на хондроитинсульфат.

Дестабилаза ε-(γ ~Glu)~Lys изопептидаза впервые была обнаружена в составе секрета слюнных желез Hirudo medicnalis в 1986 году (И.П. Баскова, Г.И. Никонов). Фермент осуществляет свою фибринолитическую (растворение тромбов) активность посредством избирательного гидролиза ε-(γ~глутамил)- лизиновых изопептидных связей, образуемых при стабилизации фибрина в присутствии фактора XIII свертывания крови и образующих поперечные сшивки (кросс-линкинги), обусловливая нетрадиционный механизм фибринолиза.

Дестабилаза представляет собой прочный белок-липидный комплекс кДа, обладает высокой агрегационной способностью. В результате агрегирования мономеров дестабилазы образуется мицелла, способная менять свою пространственную ориентацию в зависимости от природы растворителя или контактирующего субстрата, экспонируя при этом или гидрофильную, или гидрофобную части своей структуры. В результате контакта с кровью мицеллярная структура дестабилазы связывает свободные гирудин и ингибитор калликреина плазмы крови. Так формируется липосома. В водных растворах она проявляет активность всех компонентов ДК(дестабилазного комплекса) (то есть дестабилазы, аналога простациклина, гирудина и ИК), тогда как в органических растворителях демонстрирует активность лишь дестабилазы и аналога простациклина.[3], [5], [6]

Подобная структурная организация дестабилазного комплекса обеспечивает стабилизацию входящих в его состав компонентов. Но этим ее функция не ограничивается. Она облегчает проникновение их путем активного переноса через мембрану клетки (трансмембранный перенос) как при внутривенном, так и пероральном введении экспериментальным животным.

Липосомальная природа ДК обеспечивает важную физиологическую роль этого комплекса как универсального тромболитического агента. Это достигается благодаря следующим факторам:

· быстрому проникновению ДК через мембрану клетки,

· прикреплению за счет липидного компонента дестабилазы к поврежденному участку сосудистой стенки и к пристеночному тромбу,

· медленному лизису фибринового сгустка за счет изо-пептидазной активности дестабилазы,

Ÿ препятствованию дальнейшему тромбообразованию за счет блокады тромбина, калликреина плазмы крови, агрегации и адгезии тромбоцитов.

Таким образом, природная липосома дестабилазного комплекса является агентом, обеспечивающим как профилактическое противотромботическое, так и тромболитическое действие.[3]

- Коллагеназа впервые выделена в 1987 году М. Rigbi и соавторами. Она вызывает гидролиз волокон коллагена I типа и сходна с коллагеназой человека. Возможно, коллагеназа участвует в ингибировании коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов.

 

3.1.3 Блокаторы защитных реакций организма

В эту группу учеными отнесен ряд веществ полипептидной природы, которые служат ингибиторами ферментов, выделяемых различными клетками организма в ходе ответной реакции на повреждение кожи. В литературе роль этих веществ связывается с ингибированием процессов переваривания белков в кишечнике медицинской пиявки. Высказывается также предположение, что вещества этой группы выполняют защитную функцию, препятствуя повреждению внутренних структур пиявки ферментами, выделяемыми в очаге повреждения и попадающими в кишечник с поглощаемой кровью. Одним из мнений также является то, что в процессе кровоизвлечения они блокируют проявления защитной воспалительной реакции организма (развитие спазма, отека, боли и др.) с целью обеспечения питания животного. Вещества этой группы обнаружены нами в средних и особенно последних фракциях слюны, где они присутствуют в максимальных концентрациях. Некоторые из них (например, гирустазин) имеют значение и для блокирования системы гемостаза.

- Бделлины — группа полипептидов с небольшой молекулярной массой, среди которых выделяют бделлины А с молекулярной массой в 7 кДа (в этой группе наиболее изучен бделластазин с молекулярной массой 6,3 к Да) и бделлины В с молекулярной массой в 5 кДа. Методом равновесной хроматографии выделены многочисленные формы бделлинов А и В; они обозначены от А1 до А6 и от В1 до В6. И те, и другие являются сильными ингибиторами трипсина, плазмина и акрозина спермы. Они не блокируют активность химотрипсина, тканевого и плазменного калли-креинов, субтилизина. Впервые их обнаружили Н. Fritz и соавторы в 1969 году. Получена рекомбинантная форма бделластазина.

- Гирустазин - относится к тому же семейству антистазиновых ингибиторов сериновых протеаз. Выделен в 1994 году из экстрактов медицинской пиявки. Молекулярная масса гирустазина — 5,9 кДа. Он ингибирует тканевой калликреин (но не плазменный), трипсин, химотрипсин и катепсин G ней-трофилов. Способность гирустазина блокировать тканевой калликреин — очень важное свойство, так как последний катализирует высвобождение высокоактивных кининов. Кини-ны через специфические рецепторы на клетках-мишенях модулируют широкий спектр биологических активностей, в том числе участвуют в поддержании нормального кровяного давления. Гирустазин также получен в рекомбинантной форме.

- LDTI (Leech Derived Tryptase Ingibitor) - ингибитор триптазы, полученный из экстракта медицинских пиявок. Триптаза является основным компонентом секреторных цитоплазматических гранул тучных клеток и приводит к разрушению белков экстраклеточного матрикса. Известна важная роль триптазы при аллергических и воспалительных реакциях. Как и для многих уже описанных соединений, создан рекомбинантный LDTI.

- LCI (Leech Carboxypeptidase Ingibitor) - ингибитор карбоксипептидазы А. Выделен в 1998 году и имеет две изо-формы с молекулярными массами 7,3 и 7,2 кДа. Устойчив в широком диапазоне рН и температур. Так как этот ингибитор находится в составе секрета слюнных желез медицинской пиявки, можно предположить, что он может блокировать гидролиз кининов металлопротеиназами в месте прокусывания пиявкой кожи, тем самым усиливая индуцированное кининами увеличение кровотока. Создан рекомбинантный LCI.

- Эглины - низкомолекулярные белки из экстрактов медицинской пиявки с молекулярными массами 8,073 и 8,099 кДа («b» и «с» формы соответственно). Впервые их описали в 1977 году U. Seemuller и соавторы. Игибируют активность α-химотрипсина, химазы тучных клеток, субтилизина и протеиназ нейтрофилов, эластазы и катепсина G. Имеют высокую устойчивость к денатурации и прогреванию. Ингибиторный спектр эглина «с» позволяет считать его одним из важнейших пртивовоспалительных агентов.

Эти ингибиторы трипсина и плазмина впервые были обнаружены в 1969 году в коммерческих препаратах гирудина, которые обладали способностью ингибировать активность плазмина и трипсина. Они представляют собой полипептиды с молекулярной массой -7000 D (группа А) и 5600 D (группа В). Бделлины также ингибируют активность акрозина, образуя с этими ферментами неактивный эквимолярный комплекс.

К числу других полезных веществ, которые таит в себе слюна пиявки, можно отнести эглины. Впервые они обнаружены в составе коммерческих препаратов гирудина наряду с бделлинами. Они представляют группу полипептидов с молекулярной массой 6600—6800 D. Эглины ингибируют а-химотрипсин, субтилизин и нейтральные протеазы гранулоцитов человека: эластазу и катепсин G, и образуют с этими протеазами прочные комплексные соединения.

При некоторых патологических состояниях организма наблюдается повышение активности катепсинов в животных тканях. Это связано с высвобождением ферментов из лизосом. Эластаза и катепсин G относятся к группе сериновых протеаз, активных в нейтральной среде. Эластаза, гидролизующая эластин, и катепсин G выделены из полиморфно-ядерных лейкоцитов, макрофагов и других клеток. Они расщепляют протеогликаны, коллаген и ряд других белков. В норме катепсины обособлены от внутриклеточных белков в лизосомах. При повреждении тканей, а также под влиянием ряда факторов (некоторых гормонов, токсинов, иммунных комплексов) происходит выход катепсинов из клеток. Нейтральные протеазы гранулоцитов человека вовлекаются в деградацию ткани, растворимые протеазы активируют свертывающие и комплементарные факторы и таким образом, повышают воспалительный ответ при различных патологических состояниях. Ингибиторы этих протеаз способны уменьшать воспалительный ответ. Биологическая ценность этих ингибиторов зависит от их способности блокировать активность лейкоцитарных протеаз, выделяемых при воспалениях.

Еще одна удивительная составляющая слюны пиявки — это гистаминоподобное вещество. Поскольку в литературе отсутствуют сведения о его природе, трудно судить о биологической роли гистаминоподобного вещества при гирудотерапии. Однако, как отмечалось выше, в месте приставления пиявок наблюдается типичная воспалительная реакция. Очевидно, подобное проявление местного действия секрета пиявок можно отнести на счет гистаминоподобного вещества.

1234	Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: