 |
Показания к применению метода
|
|
|
|
Показания к применению нового метода начинаются там, где возникают противопоказания к применению классических методов. Идентификация патогена путем микробиологического культивирования из образцов спинномозговой жидкости или крови больного, оставаясь "золотым стандартом" диагностики, имеет серьезные ограничения, обусловленные применением антибиотиков на догоспитальном этапе. Согласно Приказу № 375 МЗ РФ "…на дому следует ввести разовую дозу пенициллина, а при тяжелой менингококцемии предпочтительнее введение левомицетина-сукцината". Подобная практика улучшает прогноз заболевания, но резко снижает число образцов СМЖ, пригодных для микробиологического и последующего эпидемиологического анализа.
В последние годы около половины больных ГБМ, поступавших в инфекционную клиническую больницу получали антибиотики на догоспитальном этапе; при этом в группе больных, получавших антибиотики на дому, летальность была менее 5%, а культуру бактерий из СМЖ (или крови) удавалось получить лишь в 30% случаев; напротив, в группе больных, не получивших антибиотики, летальность была выше 10%, а культуру бактерий получали как минимум в 60% случаев. Кроме того, бактериологическая диагностика занимает не менее суток. Таким образом, ситуация требует разработки и применения "некультуральных" методов идентификации возбудителей ГБМ.
Известным "некультуральным" методом выявления антигенов возбудителей ГБМ является метод латекс-агглютинации (ЛА) с применением соответствующих коммерческих тест-систем. Латексные частицы, покрытые специфическими антителами к антигенам Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae или Haemophilus influenzae, агглютинируют в присутствии бактериальных антигенов, содержащихся в СМЖ; результат агглютинации оценивается визуально. Постановка всей реакции занимает около 10 мин, реакция не требует наличия живых бактерий в СМЖ. Однако чувствительность метода ЛА сравнительно невысока, порядка 70%, что не удивительно, поскольку минимально определяемая концентрация бактерий в СМЖ методом ЛА составляет от 105 до 5*106 бактерий/мл или от 1 до 50 нг антигена/мл. При этом стоимость тест-систем в пересчете на одну диагностическую реакцию не менее $8.
|
|
|
Основные достоинства ПЦР:
· возможность выявления даже нескольких копий генома бактерий в образце и, как следствие; максимальная диагностическая мощность;
· чувствительность и специфичность, достигающие 100%, высокая воспроизводимость;
· сжатые (в течение нескольких часов) сроки исследования;
· умеренная и постоянно снижающаяся себестоимость (от 100 рублей на одну
· реакцию).
Показаниями к генодиагностике ГБМ являются:
· отрицательные результаты диагностики иными методами;
· использование для диагностики образцов СМЖ, взятых после антибиотикотерапии или на поздних стадиях болезни;
· необходимость срочного диагностического результата;
· замещение дорогостоящих иммунологических методов.
Прямых противопоказаний к применению генодиагностики ГБМ не существует. Однако, с одной стороны, ПЦР способна выявить малейшее бактериальное загрязнение тестируемого образца и рабочих растворов; с другой стороны, в ряде биологических жидкостей, в том числе, СМЖ возможно присутствие ингибиторов ПЦР. Поэтому только использование при постановке реакции положительных и отрицательных контролей, высокое и периодически проверяемое качество всех используемых реагентов, аккуратность выполнения исследования позволяют избежать как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов.
|
|
|
Выделение ДНК
Основное необходимое оборудование и расходные материалы:
1) настольный бокс с бактерицидной лампой ("Циклотемп", СП "РТС");
2) термостат для пробирок типа “эппендорф” на 25-1000С ("Биоком");
3) микроцентрифуга до 12-16 тыс. g. ("Elmi", "Hettish");
4) центрифуга /вортекс (“"Биоком");
5) набор автоматических пипеток переменного объема («Биоком»);
6) одноразовые наконечники с аэрозольным барьером для пипеток переменного объема, одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки на 1,5 мл («Биоком», «Хеликон»);
7) отдельный халат и одноразовые перчатки. Аналогичное оборудование и материалы общелабораторного назначения понадобится и на следующих этапах.
ДНК из бактериальной суспензии выделяется стандартными методами лизиса/сорбции/отмывания (например, с использованием наборов “ДНК-сорб”, ЦНИИ эпидемиологии) или фенол-хлороформной экстракции. Концентрации ДНК в пробе при необходимости можно определить спектрофотометрически при длине волны 260 нм. Число микроорганизмов, эквивалентных данной концентрации ДНК, рассчитывается исходя из приблизительного соотношения: 1 бактериальная клетка содержит 4 фемтограмма ДНК.
Образцы СМЖ можно использовать в реакции амплификации непосредственно; перед исследованием проба (100 мкл СМЖ, покрытые сверху 100 мкл минерального масла) инкубируется в термостате для микропробирок 20 минут при 990С для разрушения бактерий, после чего центрифугируется при 10000 g в течение 1 минуты при комнатной температуре и супернатант отбирается для постановки ПЦР. Концентрацию и чистоту ДНК в подобной пробе можно повысить, добавив этап выделения путем сорбции. При этом, чтобы убедиться, что в каждом образце СМЖ выделение ДНК прошло успешно, в образец СМЖ пред выделением ДНК добавляется внутренний контроль - препарат ДНК, например, вируса гепатита В (HBV), а также приготовляется дополнительная пробирка без СМЖ, но с HBV, которая представляет собой отрицательный контроль выделения. В дальнейшем для каждого образца СМЖ ставится реакция на выявление ДНК HBV, которая должна дать положительные результаты.
Анализ и учет результатов
Продукты амплификации выявляются и дифференцируются методом электрофореза в 1.8% агарозном геле, содержащим бромистый этидий, с дальнейшей визуализацией геля при подсвечивании ультрафиолетовым излучением. Длина амплифицированного фрагмента гена 16S РНК Neisseria – 341 пар нуклеотидов, Haemophilus - 516 п.н., Streptococcus– 792 п.н., длина специфических ампликонов N. meningitidis серогруппы А – 349 п.н., группы В – 539 п.н., С- 209 п.н.. Фиксацию, хранение и анализ полученных изображений гелей удобно проводить с помощью специализированных систем обработки изображения (Gel-Doc, БиоРад; BioTest, ЦНИИ эпидемиологии); однако при небольшом объеме исследований возможна и непосредственная визуальная оценка и/или фотографирование результатов.
|
|
|
|
|
|
