Методика окрашивания азур-2-эозином.

Эта методика также вполне пригодна для обзорных целей. Прогрессивный метод окрашивания азур-2-эозином довольно ненадежен, но регрессивный дает стабильные результаты. Основными растворами являются 0,1% водный раствор азура и 0,1% водный раствор эозина. Для приготовления рабочего раствора на 100 мл дистиллированной воды добавляют 100 капель основного раствора азура и 110-120 капель раствора эозина. Срезы помещают в раствор красителя на 12-24 ч. Затем срезы дифференцируют. Методы дифференцировки могут быть разными в зависимости от того, насколько интенсивно окрасились срезы. Дифференцировку можно проводить в подкисленной дистиллированной воде, затем промывать в чистой дистиллированной воде, обезвоживать в спиртах, просветлять в ксилоле и заключать в бальзам. При этом следует учесть, что в спиртах дифференцировка продолжается. Можно дифференцировать срезы прямо в 96% спирте. Ход дифференцировки контролируют под микроскопом. Окрасив несколько срезов, можно контролировать на глаз по цвету среза, время, от времени выборочно проверяя качество окраски под микроскопом.

Ниже описаны методики, и прописи красителей в частности гематоксилина и его приготовление для окраски срезов из книги Р. Лилли

 

ПАТОГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ГИСТОХИМИЯ

ПРОТРАВНОЕ ОКРАШИВАНИЕ ЯДЕР И ДРУГИХ СТРУКТУР

 

Квасцовый гематоксилин

Комплексы гематоксилина с солями алюминия обычно готовят, используя двойной сульфат аммония и алюминия или алюмо - аммониевые квасцы. Такие комплексы называются обычно квасцовым гематоксилином. Иногда вместо аммониевых используются калиевые или натриевые квасцы, причем результаты окрашивания не изменяются. Поскольку красящим началом является не сам гематоксилин, а продукт его окисления — гематеин, а соли алюминия в отличие от солей трехвалентного железа не являются окислителями, растворы квасцового гематоксилина перед использованием необходимо окислить или дать им «вызреть». Гематеин медленно образуется при пропускании пузырьков воздуха через растворы гематоксилина (для получения однородных результатов может понадобиться 3—4 недели), при выдерживании растворов в открытых сосудах в течение нескольких недель; гематеин образуется также в твердом красителе, хранящемся в открытом сосуде во влажной атмосфере. Большинство химических окислителей, таких, как перекиси, иодаты, перманганаты, перхлораты, окись ртути и соли трехвалентного железа, окисляют гематоксилин сразу, хотя некоторые из них действуют при нагревании.

 

Избирательность окраски ядер квасцовым гематоксилином возрастает в присутствии избытка солей алюминия или еще лучше в кислых растворах. Многие авторы предпочитают перекрашивать срезы не подкисленными растворами красителя, а затем дифференцировать их в кислоте, подкисленном спирте или других дифференцирующих агентах.

Квасцовый гематоксилин, приготовленный на 10%-ном водном растворе алюмо-аммониевых квасцов, имеет рН около 2,95; при добавлении 2% уксусной кислоты рН сдвигается до 2,34, при добавлении 4% — до 2,22.

Отмечено, что содержание гематеина в различных партиях поступающего в продажу гематоксилина различно, так что краситель иногда может представлять собой почти чистый гематеин. У меня имелись образцы гематоксилина, которые «вызревали» «естественным путем» за сравнительно короткий срок (8—10 дней). Обычный срок вызревания составляет 8—10 недель, хотя, по данным Шморля, период вызревания для гематоксилина Бемера составляет 8—10 дней. Иногда встречаются партии гематоксилина, которые оказываются сильно «переокисленным» при добавлении стандартных количеств иодата натрия. Я могу привести пример, когда 1 г NaIО3 окисляли 6 г гематоксилина. Это соотношение ниже, чем в прописи Майера, но выше рекомендованного.

Хорошо «вызревшие» растворы квасцового гематоксилина разбавляют дистиллированной водой до концентрации приблизительно 10 мг гематоксилина в 1 л. При «переокислении»- независимо от того, достигнуто ли оно за счет длительного выдерживания на воздухе или избыточной дозы окислителя,— раствор меняет цвет от пурпурного через красный до оранжевого или даже желто-коричневого.

Другие окислители

Для приготовления растворов гематоксилина с хорошими красящими свойствами на 1 г гематоксилина обычно берут 177 мг перманганата калия, 200 мг иодата натрия и 500 мг окиси ртути, но, как было показано недавно, количества некоторых из зтих окислителей можно уменьшить.

Рекомендуются следующие количества окислителей на 1 г гематоксилина: иодата натрия NaIO3 -40-100 мг, перманганата калия КМnО4 — 175 мг, периодата калия КI04 —50 мг, окиси ртути НgО — 100 мг. Первые три окислителя используют при пониженной температуре, для окисления окисью ртути необходимо кипячение. Дозы КМnО4 и КI04 следует уточнить.

Способ получения гематеина не оказывает влияния на красящие свойства гематоксилина. Различные растворы квасцового гематоксилина будут окрашивать по-разному в зависимости от количества красителя, использованного для их приготовления, степени его окисления или переокисления; избирательность окрашивания при прогрессивном методе зависит от рН раствора. Роль спирта, по-видимому, сводится главным образом к предохранению от плесени, роль глицерина - к повышению стабильности растворов по отношению к переокислению. Действительно, я наблюдал, как намерению

переокисленвые растворы гематоксилина при добавлении 30% глицерина восстанавливали при стоянии свою способность к окрашиванию.

 

В табл. 1 приведен ряд наиболее часто употребляемых прописей приготовления

квасцовых гематоксилинов из расчета на 1 л раствора. В некоторых методах рекомендуется сначала растворить гематоксилин в спирте или в воде и окислить либо на воздухе, либо добавляя окислители. По-видимому, не имеет значения, добавляются ли квасцы, глицерин, вода, уксусная кислота и другие компоненты к гематоксилину до или после его окисления; не важен и метод окисления. Спирт и глицерин могут сами окисляться химическими окислителями.

Пропись Делафильда цитируется по Майеру («Энциклопедия» Эрлиха).

Я беру 60 г квасцов, что несколько превышает количество, необходимое для получения раствора 1: 11, который Майер считает насыщенным. Маллори советует применять 15%-ный раствор квасцов и во всех прописях использует этиловый спирт. Последняя рекомендация кажется полезной.

 

Таблица №1 Прописи для приготовления 1 л квасцовых гематоксилинов
Компонент	Гемалаун Майура	Водный Маллори	По Гаррису	По Бемеру- Шморлю	Кислый ЭРЛИХА	По БАЛЛАРДУ
Гематоксилин		2,5			6,4
Алюмо-Аммонийные квасци
Этанол
Глицерин
Вода
Окислитель для вызревания	NaIO3/ 0.2 г.	нет	HgO, 2.5г	нет	нет	HgO, 8г
Возможный вариант для ускорения вызревания Время и температура созревания	15С мгновенно	25С 10 дней	100C Несколько минут	15С 8 дней Барботирование воздуха 23С, 2-6 недель	15С 6-8 недель	100С Несколько минут
Добавленная кислота:
Обычный способ	нет	нет	нет
Вариант	Лимонная 1 или уксусная,20		Уксусная ледяная, 40 мл.		Уксусная ледяная, 32 мл.	Уксусная ледяная, 34 мл.
Установленное время хранения	2-3 месяца	2-3 месяца	До года	До года	Несколько лет	Неопре-деленно долго
Стабилизатор	Хлоральгидра, 50	Тимол, 2,5

 

Как пропись Маллори, так и пропись Шморля представляют собой по существу модификацию не вполне точной прописи Бемера («Энциклопедия» Эрлиха) и цитируются по публикациям этих авторов. Пропись Майера приводится, по существу, в том виде, в каком она дается почти всеми руководствами, вышедшими после «Энциклопедии». В моей модификации в отличие от прописи Майера гемалаун содержит 0,5% гематоксилина (вместо 0,4% гематеина у Майера; «Энциклопедия» Эрлиха). Ланжерон приводит пропись более разбавленной смеси Караччи, содержащей 0,1 % гематоксилина, 0,02% иодата натрия, 20% глицерина и 5% квасцов. Пропись Апати цитируется по Ли в измененном виде: 1 %-ный гематоксилин сначала созревал в 70%-ном спирте, затем его смешивали с равными объемами глицерина и раствора, содержащего 3% уксусной кислоты и 9% квасцов.

 

Пропись Гарриса и смесь Эрлиха я привожу по «Энциклопедии». В воследней количество квасцов составляет 4%; это более чем достаточно для насыщения при 30°. Маллори ввел в пропись Эрлиха вызревание.

 

Гематоксилин Балларда

Баллард растворяет 8 г гематоксилина в 144 мл 50%-ного спирта, добавляет 16 мл ледяной уксусной кислоты и нагретый раствор 20 г алюмо - аммониевых квасцов в 250 мл воды, к нагретой до кипения смеси медленно (не допуская вспенивания) добавляет 8 г красной окиси ртути; быстро охлаждает, фильтрует и добавляет 275 мл 95%-ного спирта, 330 мл глицерина, 18 мл ледяной уксусной кислоты и 40 г алюмо-аммониевых квасцов.

Если растворам гематоксилина предоставляют созревать самопроизвольно, не используя для этого химические реактивы, то необходимо учесть, что это длительный процесс; поэтому в лаборатории следует иметь заранее приготовленные растворы гематоксилина на разных стадиях вызревания.

Я предпочитаю пользоваться растворами, содержащими глицерин, поскольку они более устойчивы, и растворами с содержанием гематоксилина 0,5% и более, так как они дают интенсивную окраску и ими можно окрасить большее число срезов. Подкисленные гематоксилины лучше использовать для обычного окрашивания ядер, но и не подкисленные гематоксилином также имеют ряд ценных свойств. Концентрация квасцов в них обычно близка к насыщению; в растворах, содержащих спирт и глицерин, она ниже, чем в водных растворах. Рекомендуется использовать алюмоаммониевые квасцы, которые представляют собой двойную сернокислую соль аммония и алюминия (NН4)2SО4*AL2(SО4)3*24Н20. Поскольку это соль сильной кислоты и довольно слабых основании, то растворы квасцовых гематоксилинов кислые: рН 2,6—2,8

 

 

МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ

 

⇐ Предыдущая12

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: