Экспресс-диагностика холеры

Холеру вызывают два биовара Vibrio cholerae. Один из них, выделенный Кохом в Египте в 1883 году, назвали классическим, другой, полученный Ф.Готшлихом на карантинной станции Эль-Тор в Северной Африке в 1906 году – V.eltor. оба биовара неагглютинирующиеся вибрионы (НАГи), галофильные парагемолитические вибрионы, продуцирующие гемолизин, и нехолерные вибрионы-кислотообразователи включены в род Vibrio семейства Vibrionaceae.

Это острая кишечная инфекция, сопровождающаяся резким обезвоживанием и обессоливанием организма. Источником инфекции является человек – больной или носитель. Механизм передачи фекально-оральный. 

 Возбудители имеютсоматический О- и жгутиковый Н-антигены. О-антиген обладает видовой и типовой специфичностью. По строению О-антигена различают долее 40 сероваров. Развивающийся к холере иммунитет носит гуморальный характер.

Материал для исследования: испражнения, рвотные массы, трупный материал.

Метод массового исследования на вибриононосительство. Материал берется непосредственно из кишечника при помощи стеклянной трубочки диаметром 0,5 см (для детей), 1,5 см (для взрослых) и длиной 15 см с оплавленными концами (при отсутствии трубочек используют ватные тампоны на деревянных палочках). Трубочку немедленно погружают во флакон, содержащий 100 – 200 мл 1% пептонной воды и агглютинирующую холерную О-сыворотку в разведении до половины ее титра. В один и тот же флакон берут материал от 10 лиц. Флаконы помещают в термостат при 37⁰С. Через 3 – 4 часа холерные вибрионы начинают агглютинироваться и постепенно (в течение ближайших 2 часов) падают в виде хлопьев на дно флакона. Исследуя под микроскопом окрашенные мазки и «висячую каплю», обнаруживают склеившихся и частично свободных вибрионов. Через 6 часов дается ответ и в случае обнаружения холерных вибрионов немедленно производится посев индивидуально от каждого из 10 лиц. Такой метод дает возможность исследовать до 16 000 человек за 3 – 4 дня.

Метод иммунодиагностической микропленки. Изучение антигенных свойств холерных вибрионов проводят путем постановки пробирочной или пластинчатой реакции агглютинации с использованием сухих лиофилизированных диагностических агглютинирующих холерных 0-сывороток и сывороток Огава и Инаба. Сыворотку раз­водят в физиологическом растворе или дистиллированной воде и смешивают при постановке агглютинации на стекле с исследуемой культурой вибрионов. При подготовке сы­воротки используется дополнительная посуда, что услож­няет работу бактериолога, а в оставшейся разведенной сы­воротке быстро прорастает бактериальная микрофлора и инактивирует ее.

Для изучения антигенной структуры холерных вибрио­нов были разработан иммунодиагностический препарат в виде микропленок разового применения, который обладал достаточной специфичностью, демонстративностью и экономичностью. Иммунодиагностические холерные микропленки (ИХМП) в виде полимерной плен­ки с нанесенными высушенными каплями, фиксированны­ми на бумаге, содержат минимальное количество сыворот­ки, пленкообразующий компонент и консервант. Пленко­образующий компонент связывает, склеивает и фиксирует микроколичества ингредиентов к поверхности носителя, исключает крошение микропленок; консервант предохраня­ет препарат от разрушения при длительном хранении.

Концентрация диагностической сыворотки в ИХМП яв­ляется достаточной, поскольку после эмульгирования в капле физраствора, антитела содержатся в титре 1:100, что полностью обеспечивает ход реакции. Тем самым обеспечивается достаточная концентрация антител, снижается, расход диагностической сыворотки и исключается возможность ее неиспользования. При этом создаются условия для быстрого растворения ИХМП, контакта ее с холерными вибрионами и проведения реакции непосредственно на по­лимерной пленке.

Готовые ИХМП хранят в темном сухом месте при 4— 7°С в картонных коробках (срок годности 3 года — срок наблюдения) и по мере надобности ИХМП используют для определения холерных вибрионов. Для исключения случай­ного заражения окружающих предметов ИХМП помеща­ют в чистую чашку Петри. На поверхность ИХМП наносят каплю физиологического раствора, в которой растворяют ее. Разведенную сыворотку смешивают с изучаемой куль­турой вибрионов, снятой бактериологической петлей с пи­тательной среды. При другом варианте постановки реак­ции ИХМП снимают скальпелем с бумажной подложки и переносят на предметное стекло, растворяют в капле физиологического раствора и смешивают с изучаемой культу­рой вибрионов.

При положительной реакции через 1—3 мин появляют­ся зерна агглютината, окрашенные в зеленый цвет, а кап­ля просветляется. При отрицательной реакции капля оста­ется гомогенно-мутной.

Использованную часть полимерной пленки отрезают, а ос­тавшуюся часть пленки с ИХМП сохраняют в той же чаш­ке Петри для дальнейших исследований. Использование ИХМП в исследованиях вибрионов и других микроорга­низмов позволяет получить статистически достоверные ре­зультаты, сэкономить дорогостоящие диагностические сы­воротки, повысить качество и эффективность исследований.

Реакция агглютинации микрометодом. В последнее время в бактериологической практике нашел довольно широкое применение микрообъемный метод постановки серологических реакций с использованием спе­циальных планшеток и микротитровальных игл.

Реакции агглютинации микрометодом ставят с холерны­ми агглютинирующими референс-сыворотками в полистроловых микротитровальных планшетках с плоским или V-образ-ным дном, предназначенных для иммунологических реакций, используются мпкротитровальные планшет­ки с объемом лунок 0,4 мл и в пробирках параллельно. Предва­рительно планшетки тщательно промывfют проточной водой, каждую лунку прополаскивали дистиллированной водой и хо­рошо просушивали, затем делали надписи простым каран­дашом.

Во все лунки четырех рядов пипеткой-капельницей из микротитратора Такачи вносят 0,85% раствор хлористо­го натрия (рН 7,2) в объеме 0,05 мл, затем в первую лунку каждого ряда — того же объема соответствующей сыворотки в разведении 1:25 и проводят ее титрацию микротитроваль-ной иглой с головкой (объем 0,05 мл), удаляя из последней лунки по 0,05 мл.

После титрации сывороток во все лунки, кроме их конт­ролей, вносят 0,05 мл взвеси исследуемой агаровой культуры. Эту манипуляцию про­водят на подносе.

По окончании титрации планшет накрывают крышкой и ставят на подносе в термостат при 37° С. После 2-часовой экспозиции проводят окончательный учет реакции под стереомикроскопом (МБС-1, МБС-2) в косопроходящем свете. При учете реакции крышку с планшетки не снимают, в случае ее запотевания заменяют другой.

После учета реакции планшетку и крышку складывают в кювет и заливают 5'% хлорамином так, чтобы все лунки планшетки были заполнены дезраствором.

Исследования показали, что все холерные вибрионы клас­сического и эльтор биоваров агглютинируются холерной ви­довой 0-сывороткой в микрообъемах.

Что касается агглютинабельности типоспецифическими сы­воротками, то прослеживается следующая закономерность:

при постановке с сывороткой Инаба в микрометоде агглюти­нировались 100, а в пробирках—90% штаммов классического холерного вибриона серовара Инаба. Холерные вибрионы био­вара эльтор серовара Инаба агглютинировались в планшет­ках и пробирках соответственно в 95 и 96% случаев. У холер­ных вибрионов классического и эльтор биоваров серовара Огава соотношения в обеих методиках были практически те же.

Интересен факт, что при постановке реакции агглютинации с RO-сывороткой наибольшее число штаммов, агглютинирующихся RO-сывороткой до титра, было выявлено в микро­методе; в пробирках агглютинация установлена у одного штамма.

Все штаммы вибрионов 040—056 сероваров в микромето­де не агглютинировались холерными агглютинирующими сыворотками, а в пробирках штамм II 258-1099 (040 серовара) агглютинировался всеми холерными сыворотками.

Большинство изученных штаммов представителей семейст­ва Enterobacteraceae также не агглютинировалось холерными агглютинирующими сыворотками, за исключением Sh. flexneri 2503, у которого в пробирках была выявлена агглютина­ция со всеми сыворотками, и штамма S. typhimurium 21, у ко­торого отмечена неспецифическая реакция агглютинации со всеми сыворотками как в пробирках, так и в планшетках.

При пользовании этим методом расход агглютинирующих сывороток уменьшается в 10 раз, значительно сокращается время, необходимое для постановки реакции, и ускоряется срок выдачи ответа. Кроме того, описанный метод менее трудоемок. Таким образом, стандартность, достоверность полученных результатов, высокая экономичность метода позволяют реко­мендовать его при идентификации холерных вибрионов, изуче­нии штаммов и популяции штаммов холерных вибрионов по признаку агглютинабельности.

А также:

Иммобилизация вибрионов холерными сыворотками и типовыми холерными фагами. Капли испражнений или материала с поверхности пептонной воды обрабатывают холерной О-сывороткой, типовыми сыворотками Огава и Инаба или типовыми холерными фагами. Готовят из них препараты «раздавленная капля», которые исследуют с помощью темнопольной и фазовоконтрастной микроскопии. В положительном случае через 3-5 минут движение вибрионов прекращается.

РИФ. Препараты из исследуемого материала обрабатывают флюоресцирующей противохолерной сывороткой и исследуют в люминесцентном микроскопе. Положительным результатом считается обнаружение в препарате даже единичных вибрионов с ярким желто-зеленым свечением в виде блестящего ободка по периферии клетки. Положительный результат можно получить через 1-2 часа после начала исследования при концентрации вибрионов не менее 10⁶ клеток в 1 мл., поэтому рекомендуется предварительно подращивание материала на питательных средах.