 |
Способы очистки белков и определение кинетики ферментативной реакции
|
|
|
|
Для подробного исследования физико-химических и биологических свойств белков, а также для изучения их химического состава и структуры непременным условием является получение белков из природных источников в химически чистом, гомогенном состоянии. Последовательность операций по выделению белков обычно состоит в следующем: измельчение биологического материала (гомогенизация); извлечение белков, точнее, перевод белков в растворенное состояние (экстракция); выделение исследуемого белка из смеси других белков, т. е. очистка и получение индивидуального белка.
Белковые вещества весьма чувствительны к повышению температуры и действию многих химических реагентов (органические растворители, кислоты, щелочи). Поэтому обычные методы органической химии, применяемые для выделения того или иного вещества из смеси (нагревание, перегонка, возгонка, кристаллизация и др.), в данном случае неприемлемы. Белки в этих условиях подвергаются денатурации, т. е. теряют некоторые существенные природные (нативные) свойства, в частности растворимость, биологическую активность. Разработаны эффективные методы выделения белков в «мягких» условиях, при низкой температуре (не выше 4°С), с применением щадящих нативную структуру химических реагентов.
Перед выделением белков из биологических объектов (органы и ткани животных, микроорганизмы, растения) исследуемый материал тщательно измельчают до гомогенного состояния, т. е. подвергают дезинтеграции вплоть до разрушения клеточной структуры.
Успешно применяется также метод попеременного замораживания и оттаивания ткани, в основе действия которого лежит разрушение клеточной оболочки, вызванное кристаллами льда. Для дезинтеграции тканей используют также ультразвук, пресс-методы (замороженный биоматериал пропускают через мельчайшие отверстия стального пресса под высоким давлением) и метод «азотной бомбы», при котором клетки (в частности, микробные) сначала насыщают азотом под высоким давлением, затем резко сбрасывают давление – выделяющийся газообразный азот как бы «взрывает» клетки.
|
|
|
Современные методы измельчения тканей обычно сочетают с одновременной экстракцией белков из гомогенатов тканей. Большинство белков тканей хорошо растворимо в 8–10% растворах солей. При экстракции белков широко применяют различные буферные смеси с определенными значениями рН среды, органические растворители, а также неионные детергенты – вещества, разрушающие гидрофобные взаимодействия между белками и липидами и между белковыми молекулами.
Из органических соединений, помимо давно применяемых водных растворов глицерина, широко используют слабые растворы сахарозы. На растворимость белков при экстракции большое влияние оказывает рН среды, поэтому в белковой химии применяют фосфатные, цитратные, боратные буферные смеси со значениями рН от кислых до слабощелочных, которые способствуют как растворению, так и стабилизации белков.
Почти все органические растворители разрывают белок-липидные связи, способствуя лучшей экстракции белков.
Для получения из биологического материала белков в чистом, гомогенном, состоянии применяют различные детергенты, способствующие расщеплению белок-липидных комплексов и разрыву белок-белковых связей Следует иметь в виду, что детергенты, вызывая разрыв белок-белковых связей, разрушают олигомерную (четвертичную) структуру белков.
После достижения полной экстракции белков, т. е. перевода белков в растворенное состояние, приступают к разделению – фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют разнообразные методы: высаливание, тепловую денатурацию, осаждение органическими растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфазных системах, кристаллизацию и др.
|
|
|
Растворение белков в воде связано с гидратацией каждой молекулы, что приводит к образованию вокруг белковой глобулы водных (гидратных) оболочек, состоящих из ориентированных в определенной форме в пространстве молекул воды. Растворы белков отличаются крайней неустойчивостью, и под действием разнообразных факторов, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок. Поэтому при добавлении к раствору белка любых водоотнимающих средств (спирт, ацетон, концентрированные растворы нейтральных солей щелочных металлов), а также под влиянием физических факторов (нагревание, облучение и др.) наблюдаются дегидратация молекул белка и их выпадение в осадок.
Высаливание. При добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов происходит осаждение белков из раствора. Обычно белок не теряет способности растворяться вновь в воде после удаления солей методами диализа или гельхроматографии. Высаливанием белков обычно пользуются в клинической практике при анализе белков сыворотки крови и других биологических жидкостей, а также в препаративной энзимологии для предварительного осаждения и удаления балластных белков или выделения исследуемого фермента. Различные белки высаливаются из растворов при разных концентрациях нейтральных растворов сульфата аммония. Поэтому метод нашел широкое применение в клинике для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении) и альбуминов (выпадают при 100% насыщении).
На величину высаливания белков оказывают влияние не только природа и концентрация соли, но и рН среды и температура.
В последнее время наибольшее распространение получили хроматографические и электрофоретические методы разделения белков.
Хроматография. Принцип хроматографии, разработанный в 1903 г. русским ученым М. С. Цветом, основан на способности пигментов (или любых других окрашенных и неокрашенных веществ) специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонке.
|
|
|
В результате происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие элюенты, которые ослабляют силы адсорбции и выносят с током раствора индивидуальные вещества. Последние последовательно собирают в коллекторе фракций (принцип сорбции-десорбции).
Чрезвычайно эффективным средством фракционирования белков из смеси оказалась колоночная хроматография с гидроксилапатитом, различными ионообменными смолами и производными целллюлозы в качестве носителей. При выделении и очистке белков используют четыре основных типа хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную и аффинную (хроматография по сродству) – в соответствии с разными физическими и химическими механизмами, лежащими в основе каждого из них. Хроматография широко применяется не только для выделения белков, но и для разделения множества других органических и неорганических веществ, входящих в состав живых организмов.
Адсорбционная хроматография. Разделение компонентов смеси (образца) основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте. В качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды алюминия или кремния.
Распределительная хроматография. В отличие от адсорбционной твердая фаза служит только опорой (основой) для стационарной жидкой фазы. Один из типов распределительной хроматографии, как и адсорбционная, осуществляется на колонках, в которых в качестве стационарной фазы применяют влажный крахмал или силикагель.
Разновидностью распределительной хроматографии является хроматография на бумаге, широко используемая в биохимических лабораториях, в том числе клинических, для разделения пептидов, аминокислот и других веществ.
Ионообменная хроматография. Ионообменные смолы являются полимерными органическими соединениями, содержащими функциональные группы, способные вовлекаться в ионный обмен. Различают положительно заряженные анионообменники, представленные органическими основаниями и аминами, и отрицательно заряженные катионообменники, содержащие фенольные, сульфо- или карбоксильные группы. Из сильно- и слабоосновных анионообменников чаще используют производные полистирола и целлюлозы. Новейшие методы ионообменной хроматографии, в частности высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), широко используются в фармакологии (при создании и определении лекарственных веществ), в клинической биохимии (при определении биологически активных веществ в физиологических жидкостях), в биотехнологических процессах и производствах и других областях: они позволяют определять вещества в нано-, пико- и фемтаграммных количествах.
|
|
|
Аффинная хроматография (хроматография по сродству). Основана аффинная хроматография на принципе избирательного взаимодействия белков (или других макромолекул) с закрепленными (иммобилизованными) на носителе специфическими веществами – лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты (когда выделяют какой-либо фермент), антигены (или антитела), гормоны или рецепторы и т. д.
Гель-хроматография. В препаративных целях, особенно при очистке белков от примесей, широко используют метод молекулярных сит, или гель-хроматографию.
Электрофорез. Метод свободного электрофореза, детально разработанный лауреатом Нобелевской премии А. Тизелиусом, основан на различии в скорости движения (подвижности) белков в электрическом поле, которая определяется величиной заряда белка при определенных значениях рН и ионной силы раствора.
Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков (как и методов оценки гомогенности) является диск-электрофорез (от англ. discontinuous – прерывистый, перемежающийся) в полиакриламидном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями рН и разной степени пористости гель.
Очистка белков от низкомолекулярных примесей
Применение в определенной последовательности ряда перечисленных методов позволяет получить белок в очищенном состоянии, не лишенный, однако, некоторых примесей солей. Для полного освобождения белков от низкомолекулярных примесей в настоящее время используют методы диализа, гельхроматографии, кристаллизации, ультрафильтрации.
При диализе применяют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная пленка), диаметр пор которых варьирует в широких пределах. Белки, как правило, не диффундируют через такую мембрану, в то время как низкомолекулярные вещества легко проникают через нее в окружающую среду.
Метод кристаллизации белков основан на достижении критической точки начала осаждения белка из раствора сульфата аммония при медленном повышении температуры. Уже получены сотни кристаллических белков. Однако не всякий кристаллический белок является гомогенным, поскольку при одной и той же концентрации раствора сульфата аммония могут кристаллизоваться близкие по размерам и массе разные белки.
|
|
|
Наилучшие результаты при освобождении белков от низкомолекулярных примесей получают с помощью гельхроматографии и ультрафильтрации. Последняя основана на продавливании растворов белка через специальные мембраны, задерживающие белковые молекулы, что позволяет не только освободить белковые растворы от низкомолекулярных примесей, но и концентрировать их.
На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому-либо физико-химическому показателю. Для этого пользуются разными критериями. Из огромного числа хроматографических, электрофоретических, химических, радио- и иммунохимических, биологических и гравитационных методов наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или других в-в.
Кинетика ферментативной реакции -т. е зависимость скорости реакции от ее условий, определяется в первую очередь свойствами катализатора.
Модель Михаэлиса-Ментена.
Исходит из того, что вначале субстрат А образует с ферментомЕ комплекс, который превращается в продукт В, намного быстрее, чем в отсутствии фермента.
Константа скорости каталитической реакции соответствует числу молекул субстрата, превратившихся в продукт одной молекулой фермента за 1 сек.
Активность фермента:
[ЕА]/[Е]t=[А]+Км[А],
где[Е]t-общая концентрация фермента
V=Ккат. [ЕА]
V=Ккат. *[Е]t*[А]/Км+[А], [М/с]
-уравнение Мехаэлиса-Ментена.
Уравнение содержит два параметра, которые не зависят от концентрации субстрата[А], но характеризуют свойства фермента.
1) Vмах. =Ккат. *[Е]t-
характеризует эффективность катализа
2) Км-константа Михаэлиса
Км=[А] при V=Vмах/2 Км=[Е]*[А]/ [ЕА],
характеризует сродство фермента к субстрату.
Высокое сродство к субстрату характеризуется низкой величиной Км и наоборот.
Все это осуществляется при определенных условиях (допущениях):
-необратимое превращение ЕА в Е+В
-достижение равновесия м/д Е, А и ЕА
-отсутствие в растроре других форм фермента, кроме ЕА и Е
|
|
|
