 |
Стадия 3. Индукция интерферона.
|
|
|
|
Для индукции используют бактериологический стерильный вирус болезни Ньюкасла с инфекционным титром не ниже 108/мл ТЦД50 в культуре куриных фибробластов. Вирус предварительно подогревают по 37,5°С.
Операция 6. Введение вируса-интерфероногена.
Культуральные колбы вскрывают под пламенем горелки и вирусосодержащую аллантоисную жидкость переливают в суспензию из расчета 10-100 ТЦД50 на I лейкоцит. Так, при содержании лейкоцитов 25 млрд. добавляют 250 млн вируса с интерфероногеным титром 109 ТЦД50. Колбу перекрывают алюминиевой фольгой с соблюдением условий стерильности и инкубируют в течение I часа при 37,5°С.
Стадия 4. Отделение индуцированных лейкоцитов.
На стадии индукции завершают подготовительные этапы интерфероногенеза.
Для улучшения переносимости препарата, после индукции необходимо удаление культуральной жидкости неадсорбировавшихся частиц вируса-индуктора и антигенов куриной аллантоисной жидкости. Для этих целей оказалось целесообразным отделение индуцированных лейкоцитов и переведение их в среду нового состава.
Операция 7. Отделение индуцированных лейкоцитов.
Суспензию индуцированных лейкоцитов центрифугируют при 600хД 15 мин 4°С, или сепарируют в условиях стерильности. Надосадочную жидкость отбирают в отдельную емкость для обеззараживания, а осадок клеток суспендируют в питательной среде следующего состава: среда № 199 или минимальная "Игла", 3 ед/мг гепарина, 5% плазмы или сыворотки донорской крови, мономицин 50 ед/мл, рН 7,2-7,4 /среда №2/.
Стадия 5. Биосинтез
Биосинтез интерферона проводят в стационарной культуре лейкоцитов. При этом происходит весьма прочное прикрепление лейкоцитов к поверхности культурного сосуда. Оказалось, что важнейшим параметром, определявшим выход активности, при стационарном культивировании является плотность посадки, то есть количество клеток на единицу поверхности. Экспериментально установлено, что оптимальным для интерфероногенеза является плотность в 5-7 млн лейкоцитов на I см поверхности. Показательно, что при такой плотности посадки лейкоциты создают пласт толщиной в 3 клетки. Хорошему прикреплению клеток способствует нанесение на внутренние поверхности культурального сосуда гидрофобного покрытия - силикона любой марки.
|
|
|
Для обеспечения питательной потребности культуры совершенно достаточно 0,1 л среды №2 на I млн лейкоцитов. Основой энергетического обмена для лейкоцитов является анаэробный гликолиз. Из-за дефектности ферментных систем начальных стадий цикла Кребса, окисление глюкозы в этих клетках завершается на стадии лактата и лишь небольшое количество (в пределах 3%) подвергается дальнейшему расщеплению. Поэтому, объем воздушной фазы в культуральном сосуде мало влияет на выход активности. Однако, заполнение средой культурального сосуда, более чем на половину его объема не рекомендуется.
Указанные выше рекомендации следует использовать при составлении клеточной взвеси в конкретных условиях.
Для каждого типа культурального сосуда необходимо подобрать оптимальные соотношения количества клеток и среды №2 (сохранив и газовую фазу), учитывая выходы активности и экономичность процесса биосинтеза.
Операция 8. Стационарное культивирование индуцированных лейкоцитов.
В матрицы, со строгим соблюдением стерильности, заливают рассчитанное количество среды №2 и вводят необходимое количество лейкоцитов. Перекрывают матрицы стерильными пробками, суспензию клеток тщательно перемешивают и устанавливают матрицы в соответствующе положение (норма "ребро") на стеллажи термального помещения с температурой 37°С. Культивирование продолжают 18-20 часов. Допускается роллерное культивирование лейкоцитов на стации биосинтеза при соблюдении вышеуказанных принципов.
|
|
|
Операция 9. Отделение отработанных лейкоцитов.
После завершения синтеза интерферон-содержащую культуральную среду подвергают центрифугированию или сепарированию с соблюдением условий стерильности для отделения отработанных клеток.
Надосадочную жидкость собирают в стерильные бутыли емкостью –10 л. Затем, для инактивации вируса - интерфероногена в каждой бутыли доводят величину рН до 2,5 добавлением при тщательном перемешивании (пипеткой, постепенно) 20%-ного раствора соляной кислоты. Правильность доведения величины рН необходимо контролировать с помощью потенциометра любой системы. Из каждом бутыли отбирают образец (10 мл) для проведения контролей, после чего бутыль перекрывают стерильной резиновой пробкой и запечатывают, на бутыль приклеивают этикетку с указанием номера серии и даты изготовления. Перед розливом по ампулам доводят рН раствора до 7,0-6,5.
Операция 10. Розлив и лиофильная сушка.
В ампулы и флаконы емкостью 5-10 мл препарат разливают по 2 мл. Во флаконы емкостью 500 мл по 50 мл.
Препарат вводят мерно с помощью дозатора или бюретки со строгим соблюдением условий стерильности. Ампулы или флаконы с препаратом перекрывают стерильными марлевыми (2 слоя) тампонами и устанавливают вертикально в кассеты сушильного аппарата. Кассеты с препаратом подвергают замораживанию при З6-40°С в течение 48-72 часов,
Лиофилизацию проводят в вакуумсушильных аппаратах любой системы.
Препарат хранят в сухом, защищенном от света месте при температуре от +4 до 10°С. Срок годности препарата 1,5 года с момента изготовления.
ТАБЛИЦА противовирусных ПРЕПАРАТОВ
| № п/п | Структурная формула | Название, синонимы | Систематическое название | Методы получения | Анализ | Разное |
| 1 | 
| Ремантадин (полирем, флумадин) | альфа-Метил-1-адамантил-метиламина гидрохлорид | |||
| 2 | 
| Дейтифорин | 1-Норборнилэтил-амина гидрохлорид | |||
| 3 | 
| Адапромин | альфа-Метил-1-адамантил-етиламина гидрохлорид | |||
| 4 | 
| Арбидол | этилового эфира 6-бром-5-гидрокси-1-метил-4-диметил-аминометил-2-фенилтиометил-индол-3-карбоновой кислоты гидрохлорид, моногидрат | |||
| 5 | 
| Бонафтон | 6-бром-1,2-нафтохинон | [10], [11] | ||
| 6 | 
| Оксолин | 1,2,3,4-тетраоксо-1,2,3,4-тетрагидро-нафталина дигидрат | |||
| 7 | 
| Теброфен | 3,5,3׳,5׳-тетрабром-2,4,2׳,4׳-тетраокси дифенил | |||
| 8 | 
| Риодоксол | 2,4,6-трийодрезорцин | |||
| 9 | 
| Флореналь | бисульфитное соединение 2-флуоренонил-глиоксаля | |||
| 10 | 
| Метисазон | тиосемикарбазон N-метилгуанина | |||
| 11 | 
| Идоксуридин (перецид, офтан-IDU, iduviran) | 5-йод-2׳-дезоксиуридан | |||
| 12 | 
| Ацикловир (ацивир, виролекс, зовиракс, цевирин) | 9-(2-гидрокси) этоксиметилгуанин | |||
| 13 | 
| Ганцикловир (цимевен, cymevene) | 9-(1,3-дигидрокси-2-пропоксиметил) цинин | |||
| 14 | 
| Фармцикловир (фамвир, famvir) | 2-[-(2-амино-9H-пурин-9-ил)этил]-1,-1-пропиндиола диацетат | |||
| 15 | 
| Рибамидил (виразол, рибавирин) | 1-бета-Д-рибофуринозил-1H-1,2,4-тиазол-3-карбоксамид | |||
| 16 | 
| Зидовудин (озидотимидин, ретровир) | 1-(3׳-азидо-2׳-дезоксирибозил) тимидин | |||
| 17 | 
| Фланозид | 7-бета-Д-глюкопиранозид-8-(3-метилбут-2-енил)-4׳,5,7-триоксилфливанон | |||
| 18 | 
| альпизарин | 2-С-бета-Д-(глюкопиранозид)-1,3,6,7-тетраоксиксантон | |||
| 19 | 
| Мегосин | 1,1׳,6,6׳-тетраокси-5,5׳-диизопропил-3,3׳-диметил-7,7׳-диоксо-8,8׳-диметиламиноэтан-сульфокислоты динатриевая соль-2,2׳-динафталина | |||
| 20 | 
| Госсипол | 2,2׳-Ди-(1,6,7-триокси-3-метил-5-изопропил-8-нафтальдегид | |||
| 21 | Полудон | полиаденил-уридиловая кислота | ||||
| 22 | 
| Камедон (camedon) неовир | натриевая соль 10-метиленкарбоксилат-9-акридина | |||
| 23 | 
| Тилорон | 2,7-бис-[2-(диэтиламино)этокси]-флуорен-9-он | [7], [8], [9] |
ЛИТЕРАТУРА
|
|
|
1. Машковский М.Д. Лекарственные препараты. Т.2. – Москва «Медицина», 1993.367с.
2. Харкевич Д.А.Фармакология. – Москва «Медицина», 1996.425с.
3. БМЭ/ Под ред. Б.В. Петровского. – М. «Сов. Энциклопедия», 1976. БСЭ/Под ред. Прохорова. – М. «Сов. Энциклопедия», 1976.673с.
|
|
|
5. Машковский М.Д. Лекарственные препараты. Т.2. – Харьков «Торсинг»,1997.423с.
6. Михайлов Клиническая фармакология. – М. «Медицина»,1983, 258с.
7. Andrews. Edwin R, Fleming Roberts W, Girisar J. Martin, Kihm James C.,Wenstup David L, Mayer Gerald D. «J. Med. Chem», 1974, 17, №8 882 – 886 (англ). (РЖХ, 8ж326, 1975).
8. О синтезе 2,7-бис-[2-(диэтиламино)этокси]-флуорен-9-он. Богатский А. В. Грень А. И. Литвинова Л. А. Лемпарт Г. В. «Доклад АН УССР» 1976г, Б, №7 610 – 612 (ред. англ.). (РЖХ, 7ж141, 1977).
9. Новые пути синтеза хлоргидрата тилорона. Burke Sister M., Jeullie Madeleine M. «Synth. Communs», 1976, 6, №5 371 –376 (англ). (РЖХ, 11ж209, 1977).
10. Получение 6-бромнафтохинона-1,2 с нитрозодисульфонатом калия.«Z. Chem». 1973г, 13, №6, 216 (нем). (РЖХ, 6ж203, 1974).
11. Бонафтон – 14С. Кивокурцева Л. Н., Булот А. Д., Боброва Н. С. «Меченные биологически-активные вещества» (Москва), 1982г, №4, 54-59. (РЖХ, 1ж188, 1983).
12. Прикладная иммунология. Под редакцией Сохина А.А. и Чернушенко Е.Ф.- Киев, 1994
13. Современные аспекты применения интерферонов и других иммуномодуляторов. Сборник научный трудов.- Москва, 1994 г.
14. Лоуренс Д.Р., Бенитт П.Н. Клиническая фармакология.- Москва, 1993 г.
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ
Адсорбция – поглощение газов, паров или жидкостей поверхностным слоем твердого тела (адсорбента) или жидкости.
Белки – природные высокомолекулярные органические соединения, построенные из остатков 20 аминокислот, которые соединены пептидными связями в длинные цепи.
Вирусы (от лат. Virus – яд), мельчайшие неклеточные частицы, состоящие из нуклеиновой кислоты (ДНК и РНК) и белковой оболочки (капсида).
Вирион – полностью сформированная вирусная частица, состоящая из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки (капсида). Хранит и переносит генетический материал вируса от одной клетки к другой.
Вирулентность – степень болезнетворности (патогенности) данного микроорганизма.
Гликопротеиды (мукопротеиды), сложные белки, содержащие углеводные компоненты. К гликопротеидам относятся многие белки плазмы крови (иммуноглобулины, трансферрины и др.), гормоны и др.
Инфекция – внедрение и размножение в организме человека или животного болезнетворных микроорганизмов, сопровождающееся комплексом реактивных процессов; завершается инфекционным заболеванием, бактерионосительством или гибелью микробов. Источник возбудителя инфекции заражает здоровых при соприкосновении, через рот (с водой и пищей), воздух (с капельками слюны и слизи), членистоногих переносчиков.
Ингибиторы – химические вещества, подавляющие активность ферментов. Используют для изучения механизма действия ферментов, для лечения нарушений обмена веществ, а также в качестве пестицидов.
|
|
|
Интерферон – защитный белок, вырабатываемый клетками млекопитающих и птиц в ответ на заражение их вирусами; неспецефический фактор противовирусного иммунитета.
Капсид – белковая оболочка вируса, предохраняющая его нуклеиновую кислоту от внешних воздействий. Состоит из отдельных одинаковых структурных единиц – капсомеров.
Транскрипция - ферментативный процесс передачи генетической информации одной цепи ДНК для синтеза комплиментарной нуклеотидной последовательности в структуре мРНК
Трансляция -процесс использования генетической информации мРНК для синтеза белка соответствующей аминокислотной последовательности
Липиды – обширная группа природных органических соединений включающая жиры и жироподобные вещества. Содержатся во всех живых клетках, один из основных компонентов биологических мембран.
Нуклеиновые кислоты – высокомолекулярные органические соединения, образованные остатками нуклеотидов. Различают ДНК или РНК кислоты. Выполняют функции передачи и хранения генетической информации, учувствуют в механизмах, при помощи которых она реализуется в процессе синтеза клеточных белков.
Нуклеозиды – гликозиды в состав которых входят пуриновое или пиримидиновое основание и углевод рибоза или дезоксирибоза. Содержится в нуклеиновых кислотах и нуклеотидах.
Паразитизм – форма взаимоотношений между организмами различных видов, из которых один (паразит) использует другого (хозяина) в качестве среды обитания и источника питания, нанося ему вред.
Репликация - процесс самоудвоения нуклеиновых кислот. Осуществляется полуконсервативным способом, когда двуспиральная ДНК деспирализуется и каждая ветвь индуцирует синтез комплементарной себе ветви при участии ДНК- или РНК-полимеразы. Ферментативный процесс репликации разделяют на три этапа: инициация, элонгация (рост цепи) и терминацию.
Сенсибилизация – повышение чувствительности организма животного и человека к воздействию каких-либо раздражителей.
Субстрат – химическое вещество подвергающееся превращению под действием фермента.
Углеводы – обширная группа природных органических соединений. Входят в состав клеточной оболочки и других структур, участвуют в защитных реакциях организма.
Ферменты – биологические катализаторы, присутствующие во всех живых клетках.
Пирогенные вещества (греч. pyr – огонь + gennao – создавать, производить; син. пирогены) – биологически активные вещества экзогенного (бактериального и вирусного) и эндогенного (клеточно-тканевого) происхождения, обладающие свойством вызывать перестройку уровня регуляции температурного гомеостаза, приводящую к повышению температуры тела и развитию лихорадки.
Пролиферация (от лат. proles – потомство и ferre – приносить, производить) – новообразование клеток в организме путем их размножения делением. Процессы деления, лежащие в основе пролиферации – амитоз и митоз. Представление о возможности образования клеток из неоформленной бластомы или “живого вещества”, а не путем пролиферации, в современной науке признаны лишенными основания. Пролиферация лежит в основе физиологической регенерации клеток, происходящей в разных тканях на протяжении всей жизни индивидуума, но с особой интенсивностью и закономерностью имеющей место в кроветворной ткани, эпителиальных покровах. Источником пролиферации при этом служат либо специальные недифференцированные материнские клетки, либо камбиальные элементы.
Простагландины – биологически активные вещества, представляющие собой производные полиненасыщенных жирных кислот, молекула которых содержит 20 углеродных атомов.
Противовоспалительные средства – лекарственные средства, подавляющие проявления воспалительных процессов.
Регенерация (позднелат. regeneratio – возрождение, возобновление) – обновление структур организма в процессе жизнедеятельности и восстановление тех структур, которые утрачены в результате патологических процессов.
Репарация – полная или неполная регенерация внутриклеточных структур, клеток, участков ткани или органа, поврежденных в результате какого-либо патологического процесса.
Таксисы (греч. taxis – построение, расположение) – двигательные реакции свободно подвижных низших растений, простейших животных, отдельных клеток многоклеточных организмов и микроорганизмов в ответ на действие раздражителя. Движение по направлению к раздражителю называется положительным таксисом, от раздражителя – отрицательным; движение не ориентированное по отношению к раздражителю, обозначают как фоботаксис.
Фагоцитоз (phagocytosis; греч. phagos пожирающий + kytos вместилище, здесь – клетка + -osis) – процесс узнавания, активного захвата и поглощения микроорганизмов, разрушение клеток и инородных частиц специализированными клетками иммунной системы. Объектом фагоцитоза являются микробы, чужеродные и измененные собственные клетки или их ферменты, комплексы антиген-антитело и др. Неотъемлемую часть фагоцитоза составляет направленное движение – хемотоксис – фагоцитов к месту локализации чужеродных частиц.
Цитостатические средства (cytostatica; греч. kytos вместилище, здесь – клетка + statikos останавливающий; син. цитостатики) – лекарственные средства, подавляющие деление клеток; используется главным образом для лечения злокачественных опухолей.
Эндокринная система – система, состоящая из специальных структур, расположенных в центральной нервной системе, различных органах и тканях, а также желез внутренней секреции, вырабатывающих специфические биологически активные вещества (гормоны). Наряду с нервной системой эндокринная система участвует в регуляции функций различных систем, органов и метаболических процессов.
Протромбин – предшественник фермента троибина, содержащийся в плазме крови. Под действием протромбина растворенный в крови белок фибриноген превращается в сгустки фибрина, тромбообразующие сосуды. Как и ряд других факторов свертывания крови (факторы VII; IX; X), протромбин синтезируется в печени под влиянием витамина К. Снижение содержания этих факторов в крови, определенное по протромбиновому времени, сопровождается выраженной кровоточивостью и возникает вследствие тяжелых заболеваний печени, недостатка в организме витамина К или нарушения его всасывания в кишечнике, при передозировке или отравлении антикоагулянтами – антагонистами витамина К.
Хромосома- (от греч. хрома – цвет, краска и сома - тело) термин предложен в 1888 году немецким морфологом В.Вальдейером, который обозначал внутриядерные структуры эукариотической клетки, хорошо окрашивающиеся основными красителями. Основной носитель наследственного материала (комплекса генов) в эукариотической клетке. Химическая организация хромосом основана на ДНК и белках, образующих нуклеопротеиновый комплекс. ДНК является материальным носителем свойств наследственности и изменчивости и содержит биологический алгоритм развития клетки, организма. Белки составляют около 65% массы хромосом и выполняют структурирующую и регуляторную функции.
Эукариоты -(от греч. eu - хорошо, полностью и karyon - ядро, орех) - организмы, обладающие сформировавшимся клеточным ядром, ограниченного от цитоплазмы оболочкой. Генетический материал заключен в хромосомах. Характерен половой процесс размножения
|
|
|
