 |
Особенности рестрикционного картирования крупных молекул ДНК
|
|
|
|
История развития геномных исследований. Геномная революция конца ХХ века
Геномика – раздел биологии, посвящённый исследованию структуры, а также механизмов функционирования и изменчивости геномов.
Геном – совокупность всех молекул ДНК организма.
Открытие ДНК Иоганном Фридрихом Мишером в 1868.
Первое представление о геномах сложилось в начале ХХ века с открытием законов генетики, формулировкой хромосомной теории наследственности и построением первых генетических карт (построение генетических карт 1913).
Выяснение роли ДНК, как носителя наследственной информации, создание модели её структуры и формулировка основных принципов молекулярной биологии заложили теоретическую основу для исследования геномов (структура ДНК 1953).
Первые методы исследования геномов, включая секвенирование ДНК, были разработаны в 60-70-е годы ХХ века. (Первое секвенирование 1977, появление базы данных PDB 1965).
Автоматическое секвенирование значительно повысило скорость расшифровки геномных последовательностей и позволило инициировать первые геномные проекты (Автоматическое секвенирование 1986 г., появление GenBank 1982, первый ПЦР 1983).
Геномная эра началась с расшифровкой первого генома бактерии группой под руководством Крейга Вентера в 1995.
К концу ХХ века были полностью расшифрованы последовательности геномов двух десятков бактерий и четырёх эукариот, опубликован «черновик» генома человека(геном дрожжей 1996, геном нематоды 1998, геном мухи 1999, геном растения 2000, геном человека 2003).
С начала ХХl века ведётся интенсивная разработка более производительных и менее дорогих технологий секвенирования, что привело к появлению геномных секвенаторов 2004.
|
|
|
В последние несколько лет опубликованы первые результаты работы в направлении синтетической геномики: химический синтез бактериального генома, его клонирование в дрожжевой клетке, трансплантации в бактериальную клетку другого вида и создание первого «синтетического» организма 2010.
Геномные проекты. Иерархический и шот-ган подходы. Фазы геномного проекта.
Ограниченные возможности методов секвенирования ДНК предопределяют дополнительные шаги необходимые для определения последовательностей генома.
· Конструирование геномных библиотек – источников фрагментов ДНК для секвенирования.
· Картирование генома – составление подробной карты генома и определение позиций фрагментов из библиотеки на этой карте.
· Секвенирование отобранных из библиотеки клонов.
· Компьютерная сборка последовательности генома из полученных коротких фрагментов последовательностей ДНК.
· Финиширование – секвенирование остающихся пробелов.
· Аннотация геномной последовательности
Два подхода к секвенированию геномов предполагают разную последовательность необходимых стадий.
Иерархический (клон за клоном):
1. Конструирование геномных библиотек
2,3 Отбор коллекции перекрывающихся клонов и физическое картирование генома
4. Секвенирование отобранных клонов
5. Аннотация генома
Шот-ган подход (метод дробовика):
1. Конструирование геномных библиотек
2. Массовое секвенирование случайных клонов
3. Компьютерная сборка перекрывающихся участков секвенированных фрагментов
4. Финиширование
5. Аннотация генома
Иерархический и шот-ган подходы к секвенированию имеют свои достоинства и недостатки:
· Качество получаемой последовательности значительно выше при иерархическом подходе
· Трудоёмкость и стоимость ниже при шот-ган подходе
· Секвенаторы 2 поколения автоматически предполагают использование шот-ган подхода (и более низкое качество получаемой последовательности)
|
|
|
Современные методы картирования геномов
Картирование геномов
· Генетическое
· Физическое
· Цитологическое
Генетические маркеры
· Ген (фенотипический маркер)
· 
RFLP
· SSLP молекулярные маркеры
· SNP
Детекция молекулярных маркеров
1. Гибридизация ДНК
2. Полимеразная цепная реакция
Типы простых последовательностей пригодные для SSLP-анализа
· Минисателлиты – повтор длиной до 25 н.п.
· Микросателлиты – ди- или тетрануклеотиды
Недостатки генетического картирования
1. Ограниченная разрешающая способность
2. Ограниченная аккуратность из-за неравномерности кроссинговера и экспериментальных ошибок
Основные методы физического картирования
1. Рестрикционное картирование
2. FISH (флуорисцентная гибридизация in situ)
3. Картирование STS-маркеров
Особенности рестрикционного картирования крупных молекул ДНК
1. Использование рестриктаз, распознающих 7 или 8 нуклеотидов
2. Использование рестриктаз, в сайт распознавания которых входят редкие комбинации нуклеотидов
3. Использование специальных методик гель-электрофореза с переменным электрическим полем для разделения крупных до 2 мб фрагментов ДНК
Модификации FISH
Главный недостаток FISH – низкое разрешение до 1 мб
Модификации:
· Механически растянутые хромосомы (разрешение до 200-300 кб, индивидуальные хромосомы распознаваемы)
· Неметафазные хромосомы (разрешение до 25 кб, индивидуальные хромосомы распознать нельзя)
· Fiber-FISH: FISH на препаратах ДНК, подготовленных путём растягивания в геле или «молекулярного причёсывания». Разрешение 10 кб и лучше.
STS-картирование
Современная альтернатива генетическому картированию.
Критерием расстояния между маркерами служит не частота рекомбинации, а частота разрывов ДНК между соседними маркерами при фрагментации генома при построении геномных библиотек.
Для STS-картирования нужны:
· STS-маркеры(короткие фрагменты ДНК длиной 100-500 п.н.)
· Набор многократно перекрывающихся фрагментов ДНК
Критерии отбора STS-маркеров:
· Последовательность ДНК 100-500 п.н.
· Эта последовательность должна встречаться в геноме 1 раз
Источники STS-маркеров:
· EST
· SSLP
· Случайные геномные последовательности
|
|
|
