 |
Библиотеки ДНК используемые при секвенировании геномов: их разновидности и способы создания.
|
|
|
|
Рестрикция геномной ДНК на фрагменты и клонирование фрагментов с помощью различных векторов создали основу формирования геномных библиотек.
Конструирование геномных библиотек значит конструирование тех фрагментов ДНК, что используются для секвенирования. Существует 2 варианта конструирования этих библиотек:
· In Vivo –характерно для методик I поколения, ПРЕИМУЩЕСТВА: библиотеки созданные in vivo можно использовать и для др. вещей, например в картировании геномов
Относят иерархический подход
· In vitro -характерно для методик II поколения, удобнее использовать
Относят шотган –подход
Типы библиотек:
· Геномная
· Клоновая
Геномная библиотека. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока.
Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами.
Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Следует отметить, что из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома.
Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК обрабатывают той же рестриктазой, добавляют к плазмидной, добавляют лигазы. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК, которую вводят в бактериальные или дрожжевые клетки. Плазмида реплицируется с образованием многих копий. Многие плазмиды несут ген устойчивости к антибиотикам, и если в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то клетки легко выявлять, выращивая на среде с антибиотиком.
Каждая такая колония представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид можно назвать библиотекой геномной ДНК. Недостаток такого метода в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.
|
|
|
Библиотека кДНК. Создание кДНК начинается с синтеза на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной нити ДНК. Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, после чего с помощью ДНК-полимеразы синтезируют комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. Такую ДНК встраивают в плазмиды и вводят в клетки бактерий. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК).
Преимущества клоновой ДНК перед клонами геномной ДНК в том, что кодирующая белок нуклеотидная последовательность гена ничем не прерывается.
Гены эукариот содержат интроны, которые должны удаляться из транскриптной РНК перед превращением ее в матричную, после чего следует сплайсинг (сращивание). Бактериальные клетки не могут осуществлять такую модификацию РНК, образовавшуюся путем транскрипции гена эукариотической клетки. Поэтому если преследуют получение белка путем экспрессии клонированного гена, то лучше использовать банк кДНК, полученной на основе матричной РНК.
Векторы – приспособленные для клонирования чужеродных фрагментов ДНК молекулы, имеющие в своём составе:
1. Точку начала репликации (Ori)
2. Селективный маркер (ген антибиотикорезистентности)
|
|
|
3. Рестрекционные сайты, удобные для клонирования.
Также в состав векторов могут входить:
· Гены, контролирующие распредиление копий вектора мужду дочерними клетками(для низкокопийных векторов)
· Теломерные последовательности (для линейных векторов)
Векторы, используемые в геномных проектах
1. Плазмиды
2. Фаговые векторы
3. Космиды
4. Искуственные хромосомы
Плазмиды. рUC. 90% сиквенсов делается на этой плазмиде. В очень редких случаях берется какой-то другой вектор, но такого же типа – небольшая высококопийная бактериальная плазмида. Используется она, т.к. это высококопийная плазмида, присутствует в клетке до 1000 копий, ее легко выделить и концентрация ее в препарате высокая, поэтому легко очищать. Получается ДНК высокого качества,….. Технологически такой вектор обеспечивает наивысшее качество сиквенса, поэтому основная масса секвенирования делается на таких плазмидах. К тому же процесс с использованием высококопийной плазмиды легко роботизировать. Недостатки, связанные с высокой копийностью:
Некоторые фрагменты геномной ДНК в принципе невозможно клонировать в таких плазмидах, т.к. даже нормальный клеточный ген, если число его копий многократно возрастает, может оказаться токсичным для клетки. Эукариотические гены тоже могут быть токсичными для бактериальной клетки. 5-10% генома в таком векторе клонировать нельзя из-за проблемы токсичности.
В такие векторы нельзя клонировать протяженные фрагменты ДНК длиной больше нескольких т.н.п. Когда в pUC делаются вставки по 20-30 т.н.п., плазмиды становятся нестабильными, т.к. копийность у плазмиды та же самая, около 50% ДНК в клетке может оказаться плазмидной. Возникает мощное селективное давление, чтобы уменьшить количество ДНК. Постоянно идут процессы рекомбинации, достаточно легко может происходить реорганизация, в первую очередь делеции и инверсии. Любая перестройка плазмиды в сторону уменьшения будет подхвачена естественным отбором. Относительно стабильными оказываются вставки размером не более 1,5-2 т.н.п.
Фаговые векторы. У них всегда больше емкость: если инсерционный вектор, емкость около 10? т.н.п., если вектор замещения фага лямбда – 20? т.н.п. К тому же при размножении бактериофага не стоит вопрос токсичности, т.к. при размножении фага клетка погибает в любом случае, а фаг реплицировать и упаковать свою ДНК успеет. Это единственная причина, по которой фаговые векторы до сих пор используются в геномных проектах. За исключением очень экзотических ситуаций у клонированных в фаговом векторе генов не имеется шанса воспрепятствовать размножению фага, и если выбирать правильные штаммы фагов, то проблем с перестройками меньше. Считается, что фаговые векторы замещения достаточно стабильны, и их до сих пор используют в крупных геномных проектах, когда нужно закрыть пробелы, которые никак не клонируются в других библиотеках. Недостатки: ДНК фага выделять гораздо менее удобно (сложнее методика, гораздо более трудоемко, автоматизировать сложнее). Поэтому фаговые векторы обычно используются на стадии финиширования, когда нужно закрыть пробелы.
|
|
|
Космидный вектор. Это гибрид плазмиды и бактериофага. Картинка неправильная: должно быть 2 cos-сайта. До начала 90-х это были векторы с максимальной емкостью (увеличена по сравнению с бактериофагом в 2 раза). Размер космиды: 53 т.н.п. (максимум, который помещается в головку фага лямбда) минус размер самого вектора – это 45-51 т.н.п. емкости. Нормальная космида несет 2 cos-сайта, т.к. фаг нормально пакует в головку линейную ДНК между двумя cos-сайтами. Приготовление космидной библиотеки – гораздо более трудоемкая методика, но такие библиотеки считаются библиотеками хорошего качества, поскольку если получен высокий титр фаговых частиц, то ДНК не надо реамплифицировать, библиотека стабильна и долго хранится. В любой момент можно инфицировать такими космидами бактериальные клетки и получить соответствующие гены.
Дрожжевые искусственные хромосомы. Эти векторы специально разработаны под проект «Геном человека». Эта программа официально стартовала в конце 90-х. Первая стадия проекта заключалась в разработке векторов. Специально под проект разрабатывались векторы с максимальной емкостью, которую можно было представить, на основе механизма сегрегации и репликации дрожжевых хромосом. Они были разработаны, на них были построены библиотеки. Емкость стандартного дрожжевого вектора – порядка 600 т.н.п., а мега-YAC – 1.4 миллиарда. Т.е. можно получить 6-7 тыс. клонов, и это будет весь геном человека. Поработали с ними лет 5, получили библиотеки, и где-то в середине 90-х выяснилось, что эти дрожжевые клоны с крупными вставками очень нестабильны. ДНК плохо хранится, ее нужно поддерживать в дрожжах, а тогда возникает та же ситуация, что и с крупными вставками в плазмидах бактерий, только в гораздо более суровом варианте: множественные внутренние реорганизации, делеции, транслокации и т.д. С таким трудом прокартированнные библиотеки, привязанные к физическим картам, оказались ни на что не годными, поскольку это уже не та ДНК, которая была в исходном геноме человека.
|
|
|
|
|
|
