Свойства гистонов животных

Структура фибриллы хроматина типа "бусин на нитке" наблюдается in vitro при очень низкой ионной силе и в отсутствие двухвалентных катионов или же без гистона Н1 даже при физиологических концентрациях солей. При повышении ионной силы в присутствии гистона Н1, который выполняет функции конденсирующего агента, в хроматине происходит структурный переход, сопровождающийся формированием равномерной фибриллы диаметром 30 нм, в которой нуклеосомы располагаются вплотную друг к другу. Предполагается, что именно такая структура хроматина на этом уровне конденсации преобладает in vivo.

В ядрах ДНК в основном входит в состав фибрилл диаметром 25~30 нм, которые образуются и в растворах с физиологическими концентрациями солей (~100 мМ NaCl), содержащих изолированный хроматин. Такие фибриллы в форме соленоида неравномерны по своей длине. С помощью электронного микроскопа в них обнаруживаются гранулы диаметром 30 нм, между которыми находятся более тонкие участки. Ю.С. Ченцов, впервые обнаруживший эти гранулы, назвал их нуклеомерами, позднее они были описаны в литературе под названием " супербидов " (super-beads). Согласно модели А. Клуга, на один шаг (10 нм) соленоида приходится ~6 нуклеосом, что приводит к уменьшению в ~6 раз длины фибриллы диаметром в 10 нм, а исходной свободной ДНК – в 40 раз. Таким образом, в соответствии с этой упрощенной картиной цепь нуклеосом на втором уровне упаковки хроматина свернута в симметрично построенный соленоид, содержащий нуклеомеры. Симметрия соленоида нарушается при взаимодействии с ним негистоновых белков.

Энергия, необходимая для образования соленоида, частично черпается из энергии взаимодействия нуклеосом друг с другом. Однако основной вклад в этот процесс вносит гистон Н1, связывание молекул которого с линкерной ДНК за пределами к ó ровых частиц обеспечивает образование компактных фибрилл диаметром 30 нм. Дифференцирующиеся клетки высших эукариот обладают способностью к синтезу целого семейства гистонов Н1, например Н1А, Н1В, Н1^о, которые имеют структурное сходство с гистоном Н5, обнаруженным в дифференцирующихся предшественниках эритроцитов. Полипептидные цепи гистонов семейства Н1, как и молекулы гистонов к ó ровых частиц, содержат центральный глобулярный домен и два гибких плеча. Глобулярный домен определяет локализацию гистона Н1 в нуклеосомах, где он взаимодействует с ДНК в месте ее входа в к ó ровую частицу и выхода из нее, стабилизируя два отрицательных супервитка ДНК, обернутой вокруг гистонового октамера. Расщепление хроматина нуклеазой микрококков приводит к освобождению гистона Н1, так как при этом происходит отщепление сегментов ДНК, с которыми он взаимодействует.

Следует подчеркнуть, что точная структура соленоида в настоящее время неизвестна. Данные, недавно полученные методом рассеивания нейтронов, указывают на то, что гистон Н1 локализован внутри хроматиновой фибриллы и на ее поперечном срезе помещается шесть нуклеосом, что хорошо соответствует модели Клуга. Однако при изучении хроматина с помощью сканирующей микроскопии было установлено, что при низкой ионной силе соленоид существует в виде нерегулярной спирали.

Петельно-доменный уровень компактизации хроматина. В интерфазных ядрах эукариот нити хроматина, в которых ДНК упакована в форме соленоида, содержащего нуклеомеры, организованы в виде топологически независимых петель, длина которых в среднем составляет 50–100 т.п.о. Такой способ пространственной укладки нитей хроматина рассматривается как следующий уровень конденсации хроматина (и ДНК) у эукариот, а сами петли получили название хромомеров. С помощью электронного микроскопа обнаружено, что нити хроматина в хромомерах имеют дополнительную специфическую укладку в виде розеток, собранных у основания, от которого отходят малые петли длиной ~5 т.п.о. (см. рис. I.2). Образование хромомеров становится возможным благодаря наличию у их оснований определенных последовательностей нуклеотидов, которые специфически взаимодействуют с ядерным матриксом, называемым иначе ядерным скэффолдом (скелетом) – сетчатообразной структурой внутри интерфазных ядер, образованной белками и РНК. Эти участки хромосомной ДНК, взаимодействующие с ядерным матриксом, в литературе известны под сокращенными названиями MAR (Matrix Associated Region) или SAR (Scaffold Associated Region) и часто обозначаются как MAR/SAR-последовательности.

Были предприняты попытки связать локализацию MAR/SAR-последовательностей на ДНК с функциональной активностью хроматина. Исследование петельной структуры хроматина в ядрах дрозофилы показало, что эти последовательности часто располагаются в окрестностях генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II, и фланкируют участки хроматина, содержащие одну или несколько транскрипционных единиц. Выяснилось, что активно транскрибируемые гены организованы в петли небольшого размера (~10 т.п.о.), тогда как "молчащие" гены находятся преимущественно в составе более крупных петель, которые содержат несколько транскрипционных единиц и, в свою очередь, образуют дополнительные петли в виде розеток (см. рис. I.2). Как правило, MAR/SAR-последовательности фланкируют гены, однако в ряде случаев их обнаруживают и внутри генов, но в составе интронов. В настоящее время выделено и охарактеризовано несколько десятков MAR/SAR-последовательностей из генома дрозофилы и других организмов. У дрозофилы они представляют собой АТ-богатые последовательности нуклеотидов длиной в 200–350 п.о., в составе которых часто встречаются участки поли(dA) × поли(dT). Обнаружены два типа блоков из АТ-богатых последовательностей: А-блок – AATAAAT/CAAA и Т-блок – TTA/TTT/ATTT/CAAA, характерные для всех MAR/SAR-последовательностей не только дрозофилы, но и других организмов. Отличающиеся от них блоки похожих последовательностей нуклеотидов – ATATTT и AATATTTT, первоначально найденные в MAR/SAR-последовательностях мышей, оказались широко представленными и в аналогичных последовательностях многих эукариот.

Можно выделить следующие обобщенные характеристики MAR/SAR-последовательностей, приведенные в недавнем обзоре М.В. Глазкова (1995 г.):

длина MAR/SAR-последовательностей составляет 300–1000 п.о.; все они содержат многочисленные сайты ДНК-белкового взаимодействия и обогащены AT-парами;

MAR/SAR-последовательности обладают способностью обратимо связываться с ядерным матриксом метафазных хромосом и локализованы исключительно в некодирующих последовательностях генома, главным образом в нетранскрибируемых участках, реже в интронах;

расстояние между двумя соседними MAR/SAR-последовательностями составляет 3–112 т.п.о., и они фланкируют один или несколько экспрессирующихся генов, для которых характерна повышенная чувствительность к нуклеазам из-за деконденсированного состояния их хроматина;

некоторые MAR/SAR-последовательности выявлены рядом с энхансероподобными регуляторными элементами. Кроме того, эти последовательности могут быть потенциальными сайтами инициации репликации и содержать в своем составе большое число сайтов для разных факторов транскрипции;

MAR/SAR-последовательности иногда соседствуют с последовательностями, способными образовывать Z- или H-формы ДНК, и в таких случаях они определяются как сайты с повышенной чувствительностью к ДНКазе I.

Все это указывает на то, что MAR/SAR-последовательности являются чрезвычайно важными в функциональном отношении последовательностями геномной ДНК эукариот. Одной из основных функций, которую им приписывают в настоящее время, может быть пространственное разграничение функциональных доменов хроматина в интерфазных ядрах эукариот, необходимое для эффективной и независимой экспрессии генов, находящихся в этих доменах. Подробнее о выполнении MAR/SAR-последовательностями функций пограничных последовательностей (инсуляторов), регулирующих экспрессию эукариотических генов, см. в разделе 3.2.4.

Являясь одними из ключевых цис- действующих генетических регуляторных элементов хромосом эукариот, MAR/SAR-последовательности осуществляют глобальный контроль изменений структуры хроматина и связанных с ними модуляций экспрессии генов на уровне транскрипции. В настоящее время считается, что эти последовательности обеспечивают поддержание функциональной структуры хромосом в интерфазных ядрах и вовлечены в процесс их конденсации при формировании метафазных хромосом во время митоза. Современная модель структуры метафазной хромосомы К.М. Харта и У.К. Лэммли (1998 г.) подчеркивает, что SAR-последовательности, пространственно примыкая друг к другу, образуют ось хроматиды, от которой в разные стороны отходят петли хроматина, формирующие тело метафазной хромосомы. Однако еще остается доказать, являются ли MAR/SAR-последовательности местами специфического прикрепления белковых комплексов, включающих, к примеру, белок конденсин, которые необходимы для конденсации хроматина.

Негистоновые белки хроматина. Большое влияние на структуру хроматина и функционирование эукариотических генов оказывают различные негистоновые белки. В ядрах в наибольшем количестве обнаруживают негистоновые белки, которые относят к так называемой группе белков с высокой подвижностью (high mobility group – HMG). Это название отражает их высокую подвижность при электрофорезе. Суммарное содержание HMG-белков в ядрах клеток в ~10 раз меньше, чем гистонов. Эти белки разделяют на три основных подкласса: 14/17, 1/2 и I/Y.

HMG 14/17 представляют собой небольшие белки с молекулярной массой 10–12 кДа, полипептидные цепи которых несут большой локальный электрический заряд при физиологических значениях рН. N-Концевые части их полипептидных цепей обладают основными свойствами, тогда как С-концевые – кислыми. К ó ровые частицы нуклеосом содержат на своей поверхности две молекулы HMG 14/17, которые соединяют между собой цепи ДНК двух соседних витков. HMG-Белки этой группы могут замещать гистон H1 в активно транскрибируемых генах. In vivo ~10% коровых частиц нуклеосом могут содержать белки HMG 14/17.

Белки группы HMG 1/2 также являются одними из преобладающих ядерных белков с молекулярной массой 25–30 кДа. Эти белки специфически связываются с одноцепочечными участками ДНК, а также участками ДНК, образующими крестообразные структуры в местах, содержащих палиндромные последовательности. Это указывает на их возможное участие в процессах рекомбинации, репарации и(или) репликации. Было показано, что белки HMG 1/2 способствуют сборке нуклеосом in vitro, однако физиологическое значение этого факта остается непонятным, поскольку многие отрицательно заряженные молекулы в экспериментальных условиях также ускоряют образование нуклеосом.

Белки HMG I/Y преимущественно взаимодействуют с АТ-богатыми участками ДНК, что характерно и для гистона Н1. Предполагается, что эти белки конкурируют с гистоном Н1 in vivo за промоторы и области начала репликации ДНК (см. разделы 2.1 и 4.1).

Помимо HMG-белков к негистоновым белкам хроматина относятся многочисленные внутриядерные ферменты и белковые факторы, необходимые для работы генетического аппарата клетки. Многим из этих белков, обеспечивающим транскрипцию, репарацию и репликацию, посвящены целые разделы этой книги. Среди негистоновых белков особое место занимают ДНК-топоизомеразы, механизмы функционирования которых целесообразно рассмотреть отдельно.