Глава 6. Современная концепция гена

Подводя итоги рассмотрению основных достижений в исследованиях структуры и механизмов функционирования генов, представляется целесообразным более подробно обсудить вопрос о том, что же такое ген в свете современных экспериментальных данных.

Классическое представление о гене как цистроне, а также модель Ф. Жакоба и Ж. Моно регуляции активности полицистронных оперонов бактерий явились вершиной развития молекулярной генетики 1960-х годов. Работы С. Бензера по изучению тонкой структуры гена rII-области бактериофага Т4 продемонстрировали предел (а точнее – беспредельность) разрешающей способности генетического анализа в применении к бактериофагам и одновременно невозможность получения таких же точных результатов при его использовании для исследования сложноустроенных организмов с более продолжительным жизненным циклом. К началу 1970-х гг. в отношении структуры и функционирования гена, по крайней мере прокариотического, складывалось вполне определенное и логичное мнение о том, что ген представляет собой непрерывную последовательность нуклеотидов ДНК, состоящую из двух частей – регуляторной и структурной. В модели гена 1960-х годов регуляторная часть всегда предшествует структурной и определяет уровень его экспрессии через взаимодействие с регуляторными белками. Структурная часть гена кодирует единственную полипептидную цепь белка или молекулу РНК и колинеарна белковому продукту, т.е. последовательность нуклеотидов гена однозначно определяет и соответствует последовательности аминокислот в кодируемом этим геном белке. Модель гена 1960-х годов предусматривает его четкие границы и постоянную локализацию на хромосоме. Изменения в первичной структуре гена и его перемещения в геноме могли быть только следствием непредсказуемых мутаций и должны были приводить к нарушению его функционирования. Таковы общие представления о гене, которые складывались в молекулярной генетике на основании экспериментальных данных до разработки методов генной инженерии. Последние 20 лет интенсивного развития молекулярной биологии и генетики с широким использованием методов рекомбинантных ДНК изменили эти представления. Сегодня совершенно ясно, что ген не всегда колинеарен РНК или белку, которые закодированы в последовательности его нуклеотидов – одна и та же последовательность нуклеотидов ДНК может кодировать разные полипептидные цепи, а нестабильность генов может быть генетически запрограммированной. Прежде чем сделать попытку сформулировать современное определение термина "ген", обобщим основные свойства генов, подробно рассмотренные в первых пяти главах книги.

Ген не всегда колинеарен своим РНК или белкам. Большинство генов эукариот обладает мозаичной структурой кодирующих и некодирующих последовательностей нуклеотидов – экзонов и интронов. Лишь в результате сплайсинга предшественников мРНК заключенные в них интроны вырезаются и восстанавливается колинеарность гена, мРНК и белкового продукта (см. раздел 2.2.3). Удаление избыточных последовательностей в результате сплайсинга происходит не только на уровне РНК, но и на уровне полипептидных цепей. Недавно обнаруженный сплайсинг белков у дрожжей S. cerevisiae и других микроорганизмов (см. раздел 3.6.4) по-новому осветил возможности механизмов, контролирующих реализацию генетической информации.

Не менее удивительными, с привычной точки зрения, являются и механизмы редактирования кодирующего потенциала РНК на посттранскрипционном уровне. Расширение исследований в этой области показывает, что такое редактирование РНК широко распространено у животных, растений и микроорганизмов. Факты корректировки генетической информации на посттранскрипционном уровне оказались неожиданными. Почему организму выгоднее не сохранять всю необходимую генетическую информацию в самом исходном гене, а корректировать ее уже в процессе реализации? К сожалению, пока на этот вопрос нет однозначного ответа. Однако можно полагать, что такая корректировка кодирующего потенциала РНК имеет непосредственное отношение к дополнительной стабилизации генетической информации в наиболее уязвимых для мутагенеза генетических локусах (см. раздел 2.2.2). Если мое объяснение верно, то существование механизма редактирования первичной структуры РНК на посттранскрипционном уровне не изменяет классических представлений о функционировании генов.

Одна и та же последовательность нуклеотидов ДНК может кодировать разные полипептидные цепи. Генетический материал многих вирусов и бактериофагов организован компактно. Например, на определенных участках генома колифага f2 или бактериофага fX174 для кодирования белка используются две возможные рамки считывания. Уникальное сверхкомпактное кодирование генетической информации характерно для мобильного генетического элемента бактерий IS5, у которого одна из цепей ДНК содержит два перекрывающихся гена, а комплементарный им участок другой цепи заключает в себе третий ген. В таких случаях можно, по-видимому, говорить о наличии в одной и той же последовательности нуклеотидов нескольких генов в классическом смысле этого слова.

Кодирование разных полипептидов одной и той же последовательностью нуклеотидов ДНК имеет место и у эукариот, а также их вирусов. Так, из одного предшественника мРНК в результате альтернативного сплайсинга образуется несколько зрелых мРНК, кодирующих разные белки (см. раздел 3.3.2). Следовательно, один и тот же ген может кодировать не один белок, а целое их семейство. Ярким примером является альтернативный сплайсинг РНК гена модулятора cAMP-респонсивного элемента человека CREM, кодирующего большое семейство позитивно и негативно действующих изоформ фактора транскрипции (см. раздел 3.3.2). К аналогичным результатам приводит альтернативный процессинг полипротеинов, кодируемых некоторыми вирусными геномами. Число подобных примеров увеличивает интересный регуляторный механизм, использующий антисмысловые РНК, синтезируемые in vivo, в качестве регуляторных макромолекул. Антисмысловые РНК в этой роли были рассмотрены в разделе 4.2.2 в связи с регуляцией репликации плазмиды ColE1, а также как природные регуляторы трансляции мРНК у бактерий. В таких случаях обе цепи ДНК данного генетического локуса оказываются кодирующими. Следовательно, кодирование одной последовательностью нуклеотидов (одним геном в классическом понимании этого термина) множественных белков и РНК – широко распространенное явление.

Перечисленные механизмы расширяют информационную емкость генома и позволяют более компактно хранить генетическую информацию. Если в случае прокариот и, особенно, вирусов тенденция к максимальной компактизации генома понятна и логично объясняется малыми допустимыми размерами самого генома, то этого нельзя сказать о геноме высших организмов. Действительно, неясным остается смысл эволюционного возникновения перекрывающихся генов эукариот при перенасыщении их генома некодирующими последовательностями нуклеотидов. По-видимому, это может отражать механизм образования таких генов в процессе эволюции, когда возникновение новой регуляторной последовательности (промотора, терминатора или сайта сплайсинга) внутри гена приводит к синтезу измененного, но функционально значимого полипептида. Образование новых генов по такому механизму могло бы происходить с использованием уже готовых нуклеотидных блоков существующих генов, а не из бессмысленных некодирующих последовательностей.

Запрограммированная нестабильность генов в геноме. Стабильность гена in vivo является одним из его жизненно важных свойств. Именно стабильность генетической информации живых организмов, проявляющаяся в сохранении фенотипических признаков в ряду поколений, делает возможным существование и самой жизни. Конечно, значение изменчивости генетического материала для эволюции в биосфере прекрасно понимали уже в самом начале развития молекулярной биологии и молекулярной генетики. Однако тогда, как и во времена де Фриза, изменение генетической информации в организме считалось редким событием, происходящим в результате генной мутации и которое чаще всего сопровождается вредными для организма последствиями, ставящими под угрозу возможность его существования.

Данные, полученные в результате работы с индивидуальными генами, обнаружили в живом организме парадоксальную ситуацию. Оказалось, что само существование большинства позвоночных животных полностью зависит не только от высокой стабильности их генома, но и от запрограммированной нестабильности ряда генетических локусов. В частности, функционирование всей иммунной системы основано на происходящих в онтогенезе животных крупномасштабных перестройках генетического материала в локусах, заключающих в себе последовательности генов иммуноглобулинов. В процессе дифференцировки B- и T-лимфоцитов на уровне их геномной ДНК имеет место перенос последовательностей нуклеотидов (V), кодирующих вариабельные участки полипептидных цепей иммуноглобулинов, а также других небольших сегментов ДНК (J и D), к последовательностям, кодирующим константные части этих белков. Объединение последовательностей нуклеотидов генов иммуноглобулинов случайным образом в разных сочетаниях, происходящее в каждой индивидуальной B- или T-клетке по-новому, приводит к образованию огромного числа разных генов иммуноглобулинов, способных направлять биосинтез антител практически любой специфичности при распознавании антигенов. Более того, в процессе возникновения генов иммуноглобулинов in vivo происходят не только перестройки генома, которые сами по себе еще не обеспечивают всего разнообразия антител. При дифференцировке лимфоцитов функционирует система, осуществляющая направленное введение случайных соматических мутаций в определенные сегменты последовательностей ДНК, которые кодируют вариабельные участки полипептидных цепей иммуноглобулинов.

Геном клеток зародышевой линии не содержит генов, появляющихся в дифференцированных клетках иммунной системы. В онтогенезе на уровне соматических клеток происходят как бы эволюционные преобразования части генетического материала, из которой возникают новые гены и соответственно новые белки с различающимися субстратными специфичностями. Какую же часть генома в данном случае можно считать геном иммуноглобулина? Классические представления о гене не позволяют ответить на этот вопрос. Дестабилизируя соответствующие генетические локусы, организм решает задачу одновременного создания большого числа разнообразных белков с использованием потенциала генома, ограниченного в своих размерах. При таком решении организму нет необходимости из поколения в поколение осуществлять передачу громадного количества генетической информации, связанной с этими белками, биологический потенциал многих из которых не будет востребован на протяжении жизни особи следующей генерации. Потомству передается лишь генетическая программа, по которой, в принципе, могут быть синтезированы все эти белки. Таким образом, у животных в клетках зародышевого пути и в большинстве соматических клеток вообще отсутствуют гены иммуноглобулинов в классическом понимании этого термина. Они возникают de novo во время онтогенеза, и невозможно предсказать, какой в точности набор генов и иммуноглобулинов будет создан при реализации такой генетической программы. С помощью непредсказуемого репертуара антител организм решает задачу защиты от не менее непредсказуемого разнообразия антигенов, которые постоянно возникают в биосфере, в том числе и вследствие природной нестабильности генов, кодирующих эти антигены. Например, запрограммированная высокая частота перестроек генов поверхностного антигена малярийного плазмодия позволяет паразиту избегать нейтрализующего влияния иммунной системы, т.е. дает возможность выжить.

В последнее время появляются данные о том, что гены, кодирующие рецепторы пахучих веществ системы обоняния позвоночных животных и человека, претерпевают перестройки, подобные таковым генов иммуноглобулинов, с теми же биохимическими последствиями. Все это указывает на то, что сейчас мы еще не осознаем до конца истинной роли индетерминизма генетической информации в жизни многоклеточных организмов как одного из основных принципов функционирования генетических систем.

В качестве еще одного примера естественной генетической нестабильности, которая приводит к созданию новых генов, не существующих у исходных организмов, рассмотрим механизм образования гена фактора s^k (или s²⁷) РНК-полимеразы Bacillus subtilis. В результате этого процесса происходит объединение в одной рамке считывания гена spoIVCB, кодирующего N-концевую часть s^k, с геном spoIIIC, в котором закодирована недостающая С-концевая часть белка. Фактор s^k в составе молекулы РНК-полимеразы функционирует только в процессе споруляции B. subtilis, обеспечивая избирательную транскрипцию бактериальных генов. При этом вновь созданный ген не передается потомству B. subtilis, так как материнские клетки перестают существовать после образования спор, а вместе с ними элиминируется и бактериальная хромосома. Такой способ регуляции экспрессии генов путем продуктивного объединения их участков на уровне геномной ДНК, по-видимому, распространен у клеток, претерпевающих терминальную дифференцировку. Более подробную информацию о функциональном непостоянстве генома можно найти в монографии Р.Б. Хесина.

Таким образом, генетически запрограммированное непостоянство определенных локусов во многих случаях жизненно необходимо. Только учитывая этот факт, следует рассматривать стабильность гена как важнейшее его свойство. Кроме того, еще одним механизмом, контролирующим темп мутационных изменений отдельных генетических локусов у про- и эукариот, может быть дифференциальная защита индивидуальных генов от химического мутагенеза как следствие их специфической пространственной организации (см. раздел 5.3.3). Генетически детерминированный уровень мутагенеза отдельных локусов может определять и предпочтительное изменение генов в филогенезе. Этот же механизм мог бы контролировать мутабильность индивидуальных генов или их частей в онтогенезе, а также объяснять возможность возникновения адаптивных мутаций (см. раздел 5.1.5).

Нуклеиновые кислоты как ферменты. До появления генной инженерии РНК отводили роль промежуточных переносчиков генетической информации (мРНК, тРНК) или приписывали структурные функции (рРНК). Современная молекулярная генетика развеяла миф о том, что биологический катализ является прерогативой белковых молекул, включив в число ферментов и нуклеиновые кислоты – рибозимы и дезоксирибозимы (см. главу 9). Выясняется все большая функциональная роль в биосинтезе белка самих рибосомных РНК как катализаторов. Несмотря на это белки среди энзимов сохраняют лидирующую позицию, так как их каталитический потенциал, скрытый в гигантском разнообразии сочетаний 20 аминокислот, несопоставим с таковым ДНК, РНК и других более просто устроенных макромолекул клетки.

Современное определение гена. Несомненно, что за время активного применения методов генной инженерии представления о гене существенно изменились. Однако можно ли сказать, что понятия гена в прежнем классическом смысле этого слова больше не существует? Несмотря на соблазн согласиться с этим, приходится ответить на вопрос отрицательно. В самом деле, незыблемым остается основной принцип, заложенный в понятие гена как фрагмента нуклеиновой кислоты, в последовательности нуклеотидов которой закодирована информация о последовательности нуклеотидов в другой нуклеиновой кислоте или аминокислотной последовательности в белке. Изменение фенотипа организма однозначно связано с мутационными изменениями генотипа, т.е. изменениями последовательности нуклеотидов во фрагменте нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), именуемом геном. Генотипические различия, как и считалось ранее, всегда передаются от родителей потомству, т.е. носят наследуемый характер. Таким образом, на сегодняшний день ген можно было бы определить как наследуемую часть генома, оказывающую влияние на какой-либо фенотипический признак. Эта формулировка по смыслу близка к классическому определению "один ген – один признак".

ЧАСТЬ II

ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ РАЗВИТИЯ ПРИКЛАДНОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ

Введение

В первой части книги были кратко рассмотрены основные результаты экспериментальных и теоретических исследований по молекулярной биологии и генетике, направленные на познание молекулярных механизмов функционирования генов. Получение этих результатов стало возможным лишь благодаря разработке современных методов манипулирования генами in vivoи in vitro и, прежде всего, методов генной инженерии. Использование таких подходов, основные принципы которых будут подробнее рассмотрены ниже, привело к созданию новых фундаментальных и прикладных направлений исследований по молекулярной генетике. Реализация ряда научных программ позволила в последнее время определить полную первичную структуру генома нескольких бактерий, включая "королеву" генетики E. coli, B. subtilis, а также дрожжей S. cerevisiae. Полным ходом идут работы по секвенированию всего генома человека и картированию его основных известных генов. Открытие каталитической активности РНК и ДНК явилось основой нового направления в молекулярной генетике, связанного с изучением и практическим использованием рибозимов и дезоксирибозимов. Наряду с этими работами бурно развивается другой комплекс исследований, связанных с антисмысловыми РНК – мощными природными и искусственными регуляторами генной активности. Разработка многочисленных и эффективных методов направленного мутагенеза сделала возможным тонкое изучение функциональной значимости конкретных последовательностей нуклеотидов в генах и аминокислотных последовательностей в белках. Это, в свою очередь, позволило перейти к искусственному конструированию новых белков с заранее заданными свойствами, в том числе с новой ферментативной активностью. Такое направление исследований получило название белковой инженерии. Введение чужеродных генов в многоклеточные организмы и осуществление их эффективной экспрессии в новом генетическом окружении привело к созданию трансгенных животных и растений. В результате был заложен прочный фундамент для генотерапии, а также клонирования целых многоклеточных организмов из отдельных соматических клеток. Современные методы молекулярной генетики революционизировали диагностику различных наследственных и приобретенных заболеваний, поскольку только они дали возможность с высокой достоверностью связать причинно-следственными отношениями конкретный генотип с конкретными патологическими состояниями организма. Такая глубина понимания молекулярных механизмов патологии недостижима другими методами и, по-видимому, лишь на этом пути возможно приближение к физиологической гармонии, т.е. к истинному здоровью человека. С учетом всего этого во второй части книги кратко рассматриваются основные достижения вышеперечисленных и некоторых других направлений молекулярной генетики, а также сделана попытка прогноза их дальнейшего развития. Изложение материала начинается с обсуждения принципов генной инженерии, так как во многом именно благодаря ей биологическая наука приобрела современный облик.