 |
Характеристика протеолитических ферментов нервной ткани нелизосомальной локализации и их биологическая роль
|
|
|
|
Пептидгидролазы нелизосомальной локализации по сравнению с таковыми лизосом изучены в меньшей степени. Причиной этому было множество факторов, среди которых можно выделить длительное время бытовавшее представление о роли внутриклеточных пептидгидролаз, как аппарате деградации белка и более высокую активность ферментов лизосом по сравнению с другими. Лизосомальные пептидгидролазы были первыми в ряду изучаемых тканевых протеиназ. Этому способствовали и факторы методического характера (доступность субстратов, разработка методов тестирования), и достижения в области биохимии и смежных наук. В частности, открытие Де Дювом лизосом в значительной степени стимулировало изучение лизосомальных ферментов, в том числе лизосомальных пептидгидролаз мозга.
Пептидгидролазы нелизосомальной локализации нервной ткани начали изучаться с некоторым опозданием по сравнению с лизосомальными, но на сегодня идет значительное опережение в выяснении физико-химических свойств и роли ферментов нелизосомальной локализации. Среди пептидгидролаз нервной ткани нелизосомальной локализации в относительно лучшей степени изучены и интенсивно исследуются в наши дни кальций-зависимые протеиназы и ферменты обмена регуляторных пептидов. Интерес к этим ферментам вполне понятен, поскольку они принимают участие в обмене если не нейроспецифических белков и пептидов, то таких, содержание которых в нервной ткани значительно выше по сравнению с другими органами и тканями. В связи с этим, надо полагать, что биологическая роль пептидгидролаз нервной ткани отражает специфику обменных процессов, раскрытие которых необходимо для понимания нейрохимических механизмов деятельности нервной системы.
|
|
|
Эндопептидазы
К эндопептидазам относятся пептид-гидролазы, катализирующие гидролиз пептидных связей внутри белковой молекулы. В настоящее время в нервной ткани обнаружено несколько эндопептидаз нелизосомальной локализации. Следует отметить, что в цитоплазме обнаружено только две эндопептидазы, способные катализировать гидролиз высокомолекулярных белков (кальпаин и мультикаталитический протеиназный комплекс), остальные эндопептидазы цитоплазмы и плазматической мембраны (эндопептидазы.,.,., пролилэндопептидаза) способны расщеплять лишь сравнительно короткие пептиды, длина которых, как правило, не превышает - аминокислотных остатков. В секреторных везикулах содержится достаточно много эндопептидаз, способных расщеплять высокомолекулярные белки, однако практически все они обладают строгой субстратной специфичностью и способны расщеплять только субстраты, содержащие пары остатков основных аминокислот. Ниже приведена характеристика наиболее важных и относительно хорошо изученных эндопептидаз нервной ткани нелизосомальной локализации.
Сигнальные пептидазы
Сигнальные пептидазы удаляют сигнальный пептид от препробелка и играют центральную роль в секреторном пути, а также в доставке белков в межмембранное пространство митохондрий. Каталитический механизм расщепления препробелков и физико-химические свойства ферментов, осуществляющих его, малоизучен. Однако полагают, что существует несколько сигнальных пептидаз, принадлежащих к новому семейству сериновых протеаз, обладающих специфичностью к определенной последовательности гидрофобных аминокислот и проявляющих максимальную активность при нейтральных значениях pH.
Прогормонконвертазы
К семейству прогормонконвертаз (фуриновых эндопептидаз) в настоящее время относят ряд субтилизиновых эндопептидаз, локализованных в секреторных везикулах различных тканей. Эти ферменты расщепляют различные пропептиды по парам основных аминокислот. Они имеют сходные физико-химические, каталитические и иммунологические свойства, но отличаются по значениям молекулярной массы, связанными с отличиями в строении С-концевого домена. Они проявляют максимальную активность при pH,-,, активируются ионами Ca+, ингибируются ЭДТА.
|
|
|
В тканевом, региональном и клеточном распределении различных ферментов данного семейства обнаружены существенные отличия. Так, фурин широко распространён во всех тканях организма, тогда как PC/ и PC локализованы, в основном, в эндокринных и нейроэндокринных клетках, а PC обнаружена в семенниках. В нейрональных клетках, осуществляющих процессинг ПОМК, экспрессируется PC, но не PC/.
В субстратной специфичности указанных ферментов также обнаружены некоторые отличия. Так, PC расщепляет хроматогранин A, а PC/ – нет, PC/ расщепляет проинсулин преимущественно при Arg-Apr, а PC – при Lys-Arg.
В настоящее время не вызывает сомнений, что прогормонконвертазы вовлекаются в процессинг предшественников биологически активных пептидов и секретируемых белков. Эти ферменты не являются пептид-специфичными, но отличия в их субстратной специфичности могут способствовать образованию различных продуктов из одних и тех же предшественников в разных тканях.
Са+ - зависимая нейтральная протеиназа
Ca+-активируемая нейтральная протеиназа (CANP, кальпаин, Ca+-зависимая нейтральная протеиназа, (К.Ф....)) впервые обнаружена в головном мозге крысы Guroff. Фермент выделен и очищен из головного и спинного мозга, а также других тканей различных видов животных.
CANP из различных источников имеет оптимум pH при pH,-, с максимумом при pH,-,, он является метал-зависимой тиоловой протеиназой и требует для проявления активности присутствия восстанавливающих реагентов. Фермент ингибируется хелатирующими агентами; N-этилмалеимидом, ПХМБ, ПХМФС, иодуксусной кислотой; ингибиторами тиоловых протеиназ лейпептином, антипаином и мерсалилом; N,a-тозил-L-лизин хлорметилкетоном; додецилсульфатом натрия; мочевиной; и полифосфатами АТФ, АДФ, ИТФ и специфичным дипептидным ингибитором кбз-Val-Phe. L-тозиламид---фенилэтилхлорметилкетон, пепстатин, апротинин, ФМСФ, бестатин, фосфорамидон, ингибиторы трипсина из сои и лимы не влияют на активность кальпаина.
|
|
|
Кальпаин является Ca+-зависимым металлоферментом. По чувствительности к ионам Ca+ выделяют три формы фермента:
а) CANP I (mCANP) – кальпаин, активируемый микромолярными концентрациями кальция, проявляет половину максимальной активности при концентрации ионов Ca+ около мкМ, максимальную – около мкМ;
б) CANP II (mCANP) – кальпаин, активируемый милимолярными концентрациями кальция, проявляет половину от максимальной активности при концетрации кальция - мкМ, максимальную – - мМ;
в) CANP III – проявляет максимальную активность при концентрации Ca+ мкМ, подвергается быстрому автолизу, после чего проявляет максимальную активность в присутствии, мкМ Ca+.
Пептидное картирование трёх форм кальпаина с различной чувствительностью к ионам Ca+ показало, что все три формы состоят из общих пептидов, достоверных отличий между этими формами не обнаружено. Моноклональные антитела, полученные к CANP II, в одинаковой степени реагируют и с CANP I и III.
CANP также активируется ионами Sr+ и Ba+, ионы Cu+, Pb+ и Zn+ ингибируют его, другие двухвалентные ионы не влияют на активность фермента.
И m- и mCANP могут быть представлены как одиночной полипептидной цепью с молекулярной массой около кДа, так и гетеродимерами, состоящими из одной большой субъединицы с молекулярной массой около кДа и - кДа и малой субъединицы, причём молекулярная масса малой субъединицы в зависимости от источника и способа выделения может колебаться от кДа до кДа. Кроме того, имеются сообщения об обнаружении трёх высокомолекулярных форм CANP с молекулярной массой в области - кДа и низкомолекулярной формы (- кДа). Все формы имели очень близкие, но не идентичные иммунологические свойства. В присутствии ионов Ca+ все формы CANP подвергаются быстрому автолизу. По-видимому, такая гетерогенность CANP может быть обусловлена не только существованием всех этих форм in vivo но и появлением их в результате автолиза при очистке. Следует также отметить, что для активации CANP II и III необходимы концентрации Ca+, значительно превосходящие физиологические, поэтому в организме эти формы являются, фактически, проферментами.
|
|
|
И кальпаин I, и кальпаин II в нервной ткани обнаруживаются как в растворимой, так и в связанной с мембранами и цитоскелетом формах, причём если на долю мембраносвязанной mCANP приходится -% от общего количества mCANP в клетке, то на долю мембраносвязанной mCANP приходится около % от общего количесва mCANP. Мембраносвязанная форма CANP ассоциирована преимущественно с миелином, но обнаруживается и в синаптических мембранах.
CANP обнаружена практически во всех тканях млекопитающих. Её содержания в ЦНС достаточно высокое. Наибольшая активность кальпаина обнаруживается в спинном мозге, несколько меньше – в амигдале, среднем мозге и белом веществе мозжечка. Активность фермента в коре больших полушарий и сером веществе мозжечка достаточно низкая. То есть, наиболее высокое содержание кальпаина наблюдается в богатых миелином областях. Фермент обнаружен как в нейронах, так и в глии. Он локализован преимущественно в нейронах неокортекса и пирамидных нейронах гиппокампа, идентифицирован в перикарионе и проксимальных дендритах этих нейронов.
CANP расщепляет большинство белков цитоскелета и нейрофиламентов, белки микротрубочек, основной белок миелина, глиальный фибриллярный кислый белок, тубулин, спектрин, миофибриллярные белки и окисленную B цепь инсулина, виментин, рецептор фактора роста эпидермиса, быстро транспортируемые белки, cdk активатор белка p, эукариотический фактор инициации G. Кальпаин также активирует кальций-активируемую фосфолипид-зависимую протеинкиназу, осуществляет ограниченный протеолиз фодрина. Имеются сведения о том, что CANP расщепляет предшественник киоторфина, динорфин -, BAM-P, a- и b-неоэндорфины, ангиотензин I и нейротензин, а также синтетические субстраты Suc-Leu-Met-NHMec, Suc-Leu-Tyr-NHMec, Boc-Val-Leu-Lys-NHMec, Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-NHMec, Boc-Leu-Thr-Arg-NHMec.
Активность фермента подавляется эндогенными ингибиторами тиоловых протеиназ цистатинами, кининогенами, ингибиторами тиоловых протеиназ из плазмы крови. Кроме этих неспецифичных ингибиторов, в различных тканях животных, в том числе и мозге, обнаружены специфичные ингибиторы CANP – кальпстатины, не влияющие на активность других протеиназ. Ингибиторы из разных тканей имеют несколько отличающиеся свойства, их молекулярная масса колеблется от кДа до кДа. Однако высокомолекулярные кальпстатины, имеющие несколько ингибиторных центров, могут подвергаться протеолизу, при этом образуются фрагменты, сохраняющие ингибиторную активность, но обладающие меньшим числом связывания с ферментом. Молекулярная масса самого короткого фрагмента, сохраняющего ингибиторную активность, составляет кДа. То есть, все многообразные формы кальпстатинов, обнаруженные в различных тканях, могут, вероятно, образовываться из одного предшественника в результате его протеолитического расщепления различной глубины. При взаимодействии кальпстатина с CANP происходит протеолиз кальпстатина, при этом образуются связанные с ферментом фрагменты, подавляющие его активность. Распределение ингибитора CANP в ЦНС соответствует таковому CANP, в особенности mCANP.
|
|
|
В различных тканях обнаружен эндогенный активатор CANP. Активатор CANP из мозга представляет собой термостабильный гомодимер с молекулярной массой кДа, он повышает активность только микро-кальпаина примерно, но при этом не изменяет сродства фермента ни к субстрату, ни к ионам Ca+. Активатор кальпаина связывается с каталитической кДа субъединицей фермента, вызывая диссоциацию гетеродимера фермента, а затем усиливает автолиз каталитической субъединицы, что и приводит к активации кальпаина. В мозге обнаружены растворимая и связанная с мембранами (цитоскелетом) формы активатора.
Исходя из способности CANP с высоким сродством гидролизовать многие белки микротрубочек и белки цитоскелета, представляется, что основные функции кальпаина нервной системы состоят в ограниченном протеолизе этих белков, что может приводить к изменению физико-химических и функциональных свойств данных белков в зависимости от потребности клетки. Фермент, вероятно, может участвовать в регуляции концентрации различных рецепторов на поверхности клеточных мембран как путём их прямого протеолиза, так путём протеолиза фодрина. Кроме того, CANP активирует кальций-активируемую фосфолипид-зависимую протеинкиназу, вовлекающуюся во внутриклеточный ответ на воздействие некоторых гормонов, и гидролизует эукариотический фактор инициации G. Таким образом, ограниченный протеолиз кальпаином специфичных белков может быть частью внутриклеточного механизма действия некоторых гормонов. CANP также вовлекается в процессы димиелинизации и клеточного апоптоза.
Синаптическая локализация CANP, его участие в гидролизе некоторых нейропептидов, вызывает соблазн предположить возможность её участия в обмене биологически активных пептидов, однако кальпаин локализован на внутренней, а не на внешней поверхности синаптической мембраны и поэтому вряд ли может вовлекаться в деградацию нейропептидов in vivo.
Нейтральная эндопептидаза
Эндопептидаза. (NEP, нейтральная эндопептидаза, энкефалиназа, энкефалиназа A, неприлизин, CALLA) – интегральный трансмемранный белок плазматических мембран, катализирующий расщепление пептидных связей внутри низкомолекулярных пептидов с N-конца остатков гидрофобных аминокислот. Она выделена и очищена из почек, семенников, гипофиза, мозга, стриатума различных видов животных. Фермент из различных источников имеет очень близкие иммунологические и физико-химические свойства, но отличается степенью гликозилирования. Поэтому молекулярная масса фермента из различных органов и тканей варьирует в пределах от кДа до кДа. Имеется единичное сообщение об обнаружении формы NEP с Mr около кДа, однако наличие этой формы может быть обусловлено агрегацией молекул фермента посредством дисульфидных мостиков. Различия в степени гликозилирования могут обуславливать и колебания pI от, до,.
NEP проявляет максимальную активность при pH около, и является Zn+-зависимой металлоэндопептидазой. Она сильно ингибируется о-фенантролином, ЭДТА, дитиотреитолом, химостатином, фосфатом и NaCl, специфичными ингибиторами тиорфаном и фосфорамидоном и другими синтетическими ингибиторами. N-этилмалеимид, ПХМБ, ФМСФ, апротинин, пуромицин, бацитрацин, ингибиторы АПФ каптоприл, SQ, SQ не влияют на её активность. Активность фермента подавляется некоторыми биологически активными пептидами и их фрагментами: Leu-энкефалином (IC мкМ), Met-энкефалином (IC мкМ), ангиотензинами I и II (IC мкМ), брадикинином (IC мкМ), Tyr-Gly-Gly-Phe (IC мкМ). Не исключено, что in vivo вышеперечисленные пептиды могут участвовать в регуляции активности фермента.
Нейтральная эндопептидаза расщепляет низкомолекулярные пептиды (с молекулярной массой, как правило, не более Да, единственное исключение интерлейкин b), состоящие не менее чем из аминокислотных остатков с N-конца гидрофобных аминокислот. Наиболее специфичным субстратом для фермента следует считать дансил-Gly-pNOPhe-bAla (Km мкМ), однако не исключено, что и он может расщепляться отличными от NEP эндопептидазами. Эндопептидаза. in vitro расщепляет различные биологически активные пептиды и их фрагменты с Km порядка - мкМ.
NEP широко распространена в тканях млекопитающих. Максимальное количество фермента содержиться в почках, примерно в раза меньшее – в семенниках, ещё в раза меньшее – в лимфатических узлах. Содержание фермента в различных отделах кишечника составляет -%, в поджелудочной железе, надпочечниках, аденогипофизе и спинном мозге – около % от такового в почках. В отделах головного мозга содержание фермента в - раз меньше, чем в спинном мозге. Максимальная активность NEP обнаружена в стриатонигральном пути, в - раз ниже (в порядке убывания) – в мозжечке, коре больших полушарий и таламусе.
В нервной системе NEP обнаружена в нейронах, Шванновских клетках периферических нервов, формирующих миелин, гонадотропных клетках гипофиза. Фермент локализован на пресинаптической и постсинаптической мембранах и мембранах терминалей аксонов. На мембранах дендритов и клеток глии он не обнаруживается. В стриатонигральном пути фермент связан с афферентными волокнами. Показана локализация молекул NEP вблизи m- и/или d-опиоидных рецепторов и рецепторов вещества P.
Полагают, что биологическая роль NEP в ЦНС заключается в генерализованной деградации нейропептидов после связывания последних с рецепторами и модуляции нейропептидов после их секреции из пресинаптической мембраны. Однако NEP не является ферментом, отвечающим за деградацию одного какого-то определённого нейропептида или группы нейропептидов, а вовлекается в деградацию большого числа нейропептидов.
Эндопептидаза
Эндопептидаза. (КФ...) – цинк-зависимый металлофермент, состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой от кДа до кДа, проявляет максимальную активность при pH около,, активируется дитиотреитолом. Он ингибируется ЭДТА, ЭГТА,-фенантролином, N-этилмалеимидом, гидроксимеркурийбензоатом и специфическим ингибитором N-[-(R,S)-карбокси--фенилпролил]-Ala-Ala-Phe-п-аминобензоатом. ФМСФ не влияет на его активность.
Наиболее высокое содержание фермента обнаружено в мозге, семенниках и гипофизе, в остальных тканях содержание фермента очень низкое. В мозге наиболее высокая активность фермента найдена в клетках Пуркинье мозжечка, клетках зубчатой извилины гиппокампа и отдельных ядрах гипоталамуса. Эндопептидаза. обнаружена как в нейронах, так и в клетках глии. Около % фермента находится в растворимой форме и % связано с мембранами.
Эндопептидаза. превращает некоторые проэнкефалин и продинорфин-происходящие пептиды в энкефалины и деградирует различные биологически активные пептиды: брадикинин, нейротензин ангиотензины I и II, рилизинг фактор лютеинизирующего гормона расщепляет человеческий белок-предшественник амилоида.
Специфический ингибитор фермента N-[-(R,S)-карбокси--фенилпролил]-Ala-Ala-Phe-п-аминобензоат блокирует образование Leu-энкефалина из динорфина -, a- и b-неоэндорфинов и Met-энкефалина из Met-энкефалин-Arg-Gly-Leu, вызывает антиноцепцию и сильное снижение артериального давления.
В настоящее время не вызывает сомнений, что эндопептидаза. вовлекается в обмен биологически активных пептидов, в частности образование энкефалинов из коротких предшественников, в деградацию брадикинина и рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона.
Эндопептидаза. (нейролизин, КФ...) обнаружена в растворимой и в мембранной фракциях мозга и почек, показано, что фермент присутствует в астроцитах. Обе формы фермента обладают очень близкими свойствами, имеют молекулярную массу около кДа, pI,-,, состоит из одной полипептидной цепи и не является гликопротеином. Фермент проявляет максимальную активность при pH,, ингибируется дитиотреитолом, ЭДТА и N-(фенилэтилфосфонил)-Gly-L-Pro-L-аминогексановой кислотой; ингибиторы АПФ и эндопептидаз. и. не влияют на его активность. Фермент расщепляет нейротензин, брадикинин, вещество P, ангиотензины I и II, люлиберилин, динорфины - и - и a-неоэндорфин. Динорфин - является мощным ингибитором (IC =, мкМ) эндопептидазы. и не расщепляется ею, поэтому Barelli et al. считают, что динорфин - участвует в регуляции концентрации нейропептидов in vivo посредством ингибирования активности эндопептидазы.. Считают, что in vivo фермент вовлекается в обмен биологически активных пептидов, но он не является пептид-специфичным, как можно подумать из его названия – «нейролизин».
Пролилэндопептидаза
Пролилэндопептидаза (КФ...) расщепляет пептидные связи с С-конца пролина. Фермент мозга имеет Mr кДа, проявляет максимальную активность при рН,, ингибируется диизопропилфторфосфатом и кбз-Pro-пролиналом, активируется дитиотреитолом. Наиболее высокая активность фермента в мозге обнаружена в коре больших полушарий, стриатуме и гиппокампе, перепады уровней активности фермента в мозге не превышают - раз. Он гидролизует пептиды, содержащие от до аминокислот, расщепляет тиролиберин, ангиотензин, брадикинин, нейротензин, вещество P. Вероятно, биологическая роль фермента заключается в гидролизе пролин-содержащих пептидов.
|
|
|
