 |
Рибосома: Декодирующий сайт: Структура
|
|
|
|
ТРАНСЛЯЦИЯ
Трансляция: Общие сведения
Трансляция - процесс синтеза белка в цитоплазме клетки. Молекулярные процессы, лежащие в основе синтеза белка, крайне сложны (Kornberg R.D. et al, 1981; McGhee J.D. et al, 1980).
В синтезе белка участвует три таких класса молекул РНК (мРНК, тРНК и рРНК). Началом синтеза белка принято считать процесс транскрипции ДНК, в результате которого в ядре должна образоваться соответствующая информационная, или матричная, РНК (мРНК), которая затем должна перейти в цитоплазму клетки.
Процесс трансляции начинается с присоединения малой рибосомной субчастицы к молекуле мРНК. Особая инициаторная тРНК связывает малую рибосомную субчастицу со специальным старт- кодоном на мРНК. Присоединение большой субчастицы завершает сборку рибосомы.
Далее следует фаза элонгации. Каждая очередная аминокислота (находящаяся в комплексе с tРНК) присоединяется к карбоксильному концу растущего полипептида с помощью циклического процесса, состоящего из трех последовательных этапов: связывания аминоацил-тРНК, образования пептидной связи и транслокации рибосомы. Рибосома перемещается вдоль молекулы мРНК в направлении 5'-> 3' от одного кодона к другому до тех пор, пока не будет достигнут какой-либо из трех стоп-кодонов. К этому стоп-кодону присоединяется затем фактор освобождения, останавливающий трансляцию и вызывающий отделение завершенного полипептида от рибосомы. Энергия для биосинтеза белка обеспечивается гидролизом GTP.
Большинство данных о механизмах биосинтеза белка у эукариот было получено с использованием бесклеточных белоксинтезирующих систем. Важные результаты о механизмах трансляции у эукариот были получены с использованием стабильно трансформированных клеток животных и растений, выращиваемых в культуре. Установлено, что у растений и животных в основном функционируют одни и те же механизмы трансляции.
|
|
|
Клетки животных, кроме основной системы трансляции, локализованной в цитоплазме, имеют дополнительную систему трансляции митохондрий, которая по ряду свойств приближается к бактериальной. Клетки растений обладают дополнительной системой биосинтеза белка, функционирующей в хлоропластах.
РИБОСОМЫ
Рибосомы: строение
Рибосомы представляют собой крупный рибонуклеопротеидный комплекс с молекулярной массой около 2,5 мДа, состоящий из рибосомных белков, молекул рРНК и ассоциированных с ними факторов трансляции.
Рибосомы прокариотических и эукариотических организмов различаются по размерам. У эукариот они представлены 80S частицами, тогда как коэффициент седиментации рибосом прокариот составляет 70S.
Рибосомы всех известных организмов построены из двух неравных субчастиц: прокариотические - 30S и 50S, а эукариотические - 40S и 60S. 70S рибосомы эубактерий в своем составе содержат 55-60 рибосомных белков, для 80S рибосом эукариот это число составляет 75-85. В обоих случаях рибосомные белки в составе рибосом ассоциированы с молекулами рРНК, образуя пространственно организованные рибонуклеопротеиновые тяжи.
На рис. I.18 (http://humbio.ru/humbio/genexp/001ab46f.htm) представлена модель пространственной структуры 70S рибосомы E.coli, разработанная в лаборатории Д. Франка (США).
Рибосомные белки E.coli
Более 50 рибосомных белков выделено в высокоочищенном состоянии. Молекулярная масса самого маленького белка составляет 5 кДа, самого большого - 61 кДа, большинства рибосомных белков - 10-20 кДа. Определены аминокислотные последовательности полипептидных цепей всех рибосомных белков E.coli. Малая рибосомная субчастица содержит 21 белок с суммарной молекулярной массой 350 кДа.
|
|
|
Белки в составе 30S субчастицы ассоциированы с 16S РНК, длина которой составляет 1542 нуклеотида (нт). Суммарные молекулярные массы малой и большой субчастиц рибосом достигают соответственно 850 и 1450 кДа. Третья часть массы большой субчастицы приходится на 34 рибосомных белка, а две третьих - на 23S (2904 нт) и 5S рРНК (120 нт).
Обнаружены специфические внутримолекулярные и межмолекулярные взаимодействия между различными функциональными участками рРНК. На прямое участие 23S рРНК в трансляции указывает наличие специфических комплементарных взаимодействий между ней и CCA- концами тРНК, акцептирующими аминокислотные остатки.
Рибосома: бороздки
Информационная РНК шаг за шагом продвигается сквозь рибосому в процессе трансляции. В рибосоме имеется бороздка, удерживающая растущую полипептидную цепь, и бороздка, удерживающая молекулу мРНК. Длина бороздок такова, что в первой из них умещается примерно 30 аминокислот, а во второй - около 35 нуклеотидов РНК. В синтезе белка непосредственно участвуют только два из одиннадцати кодонов, находящихся одновременно в рибосоме (Sandeen G. et al, 1980).
Рибосома: участки связывания с тРНК
В рибосоме имеется два разных участка, связывающих молекулы тРНК. Один из них удерживает молекулу тРНК, присоединенную у растущему концу полипептидной цепи; поэтому его называют пептидил-тРНК-связывающим участком или P-участком (донорным участком). Второй служит для удержания только что прибывшей молекулы тРНК, нагруженной аминокислотой; его называют аминоацил-тРНК-связывающим участком или A-участком (акцепторным участком). К обоим участкам молекула тРНК прочно прикрепляется только в том случае, если ее антикодон спаривается с комплементарным ему кодоном мРНК. A- и P-участки располагаются очень близко друг к другу, так что две связанные с ними молекулы тРНК спариваются с двумя соседними кодонами в молекуле мРНК (Ptashne M. et al, 1970; Ohlendorf D.H. et al, 1982).
Когда оба участка заняты, происходит образование пептидной связи в результате следующей реакции: полипептидный компонент комплекса пептидил-тРНК переносится на аминокислоту, связанную в аминоацил-тРНК (реакция транспептидации). Эта реакция происходит на большой субчастице рибосомы.
|
|
|
Тот конец тРНК, который несет аминокислоту, расположен на большой субчастице, тогда как другой ее конец, т.е. антикодон, взаимодействует с мРНК, связанной малой субчастицей. Следовательно, расположение участков P и A таково, что в их образовании принимают участие обе рибосомные частицы.
Рибосома: Декодирующий сайт: Структура
Для правильного кодон-антикодонового спаривания в декодирующем сайте рибосома должна провести "выравнивание" последовательностей транспортной и матричной РНК и катализировать образование пептида, связанного с другим концом тРНК и пептидил-трансферазным сайтом.
Декодирующий сайт, имеющий в своем составе сайт связывания тРНК (А-сайт) и пептидильный сайт (П-сайт), включает в себя несколько консервативных районов 16S рРНК, организованных в сложную, высокоупорядоченную структуру. Сшивки между основаниями антикодона N-ацетил-валил-тРНК в П-сайте и нуклеотидом С 1400 на 16S рРНК, индуцированные ультрафиолетовым излучением, указывают на близкое (на расстоянии нескольких ангстрем) размещение кодон-антикодонового сайта и мРНК от нуклеотида С 1400, в ложбинке 30S субъединицы (Prince et al., 1982). Область нуклеотида 1400 (1392-1400) высококонсервативна у всех немитохондриальных рибосомных РНК.
Было показано, что молекула 16S рибосомной РНК содержит три типа сайтов, защищаемых или подвергающихся конформационным изменениям в результате неэнзиматического взаимодействия тРНК с малой субъединицей рибосомы: А-сайт, П-сайт и районы, перекрываемые транспортной РНК и 50S субъединицей рибосомы (Moazed and Noller, 1986). Почти все нуклеотиды, выявленные авторами, высококонсервативны, что согласуется с их предполагаемой функциональной ролью. Хотя защищенные районы расположены в различных областях вторичной структуры 16S рРНК, при ее укладке в трехмерную модель они оказываются в области бороздки 30S субъединицы. Исключением является область 530 нуклеотида, которая предположительно защищается транспортной РНК вследствие аллостерически индуцированных конформационных изменений.
|
|
|
Структурные данные свидетельствуют, что транспортные РНК образуют тесные контакты с большим количеством специфических нуклеотидов мРНК, при этом возможно различение А- и П-сайтов рибосомной РНК. Исследования активной 30S субъединицы, способной к неэнзиматическому связыванию тРНК, выявили изменения реактивности, практически полностью сопряженные с теми же областями мРНК (Moazed et al., 1986). Эти данные свидетельствуют о важности конформационных изменений рРНК для выполнения рибосомой биологических функций.
Функциональные данные из разных источников согласуются с данными о структуре декодирующего сайта, полученными методом фут-принтинга. Первые свидетельства такого рода были получены в экспериментах с химической модификацией рРНК и блокадой ферментативного расщепления 16S рРНК транспортной РНК, стрептомицином или тетрациклином, связанными с А-сайтом (Nomura and Held, 1974). Функциональные сайты на рибосоме выявлялись с помощью антибиотиков, нарушающих кодирование (Moazed and Noller, 1987). Оказалось, что сайты на 16S рРНК, защищаемые антибиотиками, тесно коррелируют с сайтами, защищаемыми тРНК. Так например, эдеин блокирует связывание тРНК с П-сайтом и защищает нуклеотиды G 693, A 794, C 795 и C 926, которые защищаются также и тРНК. Структурно близкие аминогликозиды (неомицин, парономицин, гентамицин и канамицин), нарушающие кодирование, оказывают сходный защитный эффект на нуклеотиды A 1408 и G 1494. Предполагается, что мишенью их действия является А-сайт. Резистентность к этим антибиотикам является результатом модификации рРНК в декодирующем сайте.
Белкового синтеза стадии
Различают три стадии белкового синтеза: инициацию, элонгацию и терминацию. На каждой из них в работе рибосомы участвуют различные группы дополнительных факторов. Энергия для биосинтеза белка на всех трех стадиях обеспечивается гидролизом GTP.
При инициации (Hunt T., 1980) происходят события, предшествующие образованию пептидной связи между двумя первыми аминокислотами белка. Для инициации необходимо, чтобы рибосома связалась с информационной РНК, образовав инициирующий комплекс совместно с первой аминоацил-тРНК. Это относительно медленная стадия в синтезе белка.
Элонгация (Clark B., 1980) включает в себя все реакции - от образования первой пептидной связи до присоединения последней аминокислоты к белковой молекуле. Это наиболее быстрая стадия белкового синтеза, во время которой рибосома перемещается от первого до последнего кодона на информационной РНК.
|
|
|
Терминация (Caskey C.T., 1980) состоит из последовательных этапов, необходимых для освобождения синтезированной полипептидной цепи; при этом рибосома отделяется от мРНК. По сравнению со временем, требующимся для включения аминокислоты в полипептидную цепь, диссоциация проходит медленно.
Только в сравнении со скоростью элонгации и можно считать, что стадии инициации и терминации происходят медленно. Синтез белка - это быстрый процесс (хотя скорость в большей степени зависит от температуры). В ретикулоцитах, например, при 37 градусах Цельсия скорость элонгации составляет 2 аминокислоты в 1 сек.
Предполагается, что скорость белкового синтеза у эукариот регулируется факторами инциации (Ochoa S. et al, 1979; Ranu R.S., 1980).
|
|
|
