Специальные питательные среды для культур клеток.

Используются разнообразные синтетические вирусологические питательные среды сложного состава, включающие большой набор различных факторов роста - среда 199, Игла, раствор Хэнкса, гидролизат лактальбумина. В среды добавляют стабилизаторы рН (Hepes), различные в видовом отношении сыворотки крови (наиболее эффективной считают эмбриональную телячью сыворотку), L-цистеин и L-глютамин.

В зависимости от функционального использования среды могут быть ростовые (с большим содержанием сыворотки крови) - их используют для выращивания клеточных культур до внесения вирусных проб, и поддерживающие (с меньшим содержанием сыворотки или ее отсутствием) - для содержания инфицированных вирусом клеточных культур.

Выявляемые проявления вирусной инфекции клеточных культур:

1.) Цитопатический эффект. Цитопатогенное действие (ЦПД) вирусов – видимые под микроскопом морфологические изменения клеток (вплоть их отторжения от стекла), возникающие в результате внутриклеточной репродукции вирусов.

2.) Выявление телец включений. Включения – скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения – тельца Гварниери, вирусы герпеса и аденовирусы – внутриядерные включения.

3.) Выявление вирусов методом флюоресцирующих антител (МФА), электронной микроскопией, авторадиографией.

4.) Цветная проба. Обычный цвет используемых культуральных сред, содержащих в качестве индикатора рН феноловый красный, при оптимальных для клеток условиях культивирования (рН около 7,2) - красный. Размножение клеток меняет рН и соответственно - цвет среды с красного на желтый за счет смещения рН в кислую сторону. При размножении в клеточных культурах вирусов происходит лизис клеток, изменения рН и цвета среды не происходит.

5.) Выявление гемагглютинина вирусов - гемадсорбция, гемагглютинация. Эти реакции основаны на способности некоторых вирусов вызвать агглютинацию (склеивание) эритроцитов за счёт вирусных гликопротеиновых шипов – гемагглютининов.

6.) Метод бляшек (бляшкообразования). В результате цитолитического действия многих вирусов на клеточные культуры образуются зоны массовой гибели клеток. Выявляют бляшки - вирусные “ клеточно - негативные” колонии – ограниченные участки разрушенных вирусами клеток, культивируемых на питательной среде под агаровым покрытием, видимые как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Один вирион образует потомство в виде одной «бляшки». Метод «бляшек» используют для дифференциации вирусов и определения их концентрации.

Заражение лабораторных животных. Выбор экспериментальных животных определяется целью работы и видовой чувствительностью к изучаемому вирусу. Для заражения используют обезьян, кроликов, морских свинок, хомячков, белых крыс и мышей. Лабораторных животных заражают различными способами в зависимости от тропизма вируса к определенным тканям. Так, например, для культивирования нейротропных вирусов заражение производят преимущественно в мозг (вирусы бешенства, клещевого энцефалита и др.), культивирование респираторных вирусов осуществляется при интраназальном инфицировании животных (вирусы гриппа), дерматотропных (вирус оспы) - путем накожного и внутрикожного заражения. Наиболее часто используются накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное и внутримозговое заражение. При первичном заражении животные могут не заболеть, поэтому через 5-7 дней внешне здоровых животных выводят из эксперимента, а из их органов готовят суспензии, которыми заражают следующие партии животных. Эти последовательные заражения называются «пассажами».

Индикацию, т.е. обнаружение факта репликации вируса, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за счет поверхностного вирусного белка - гемагглютинина. В настоящее время использование животных для культивирования вирусов ограничено, в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных научных целях.

Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах. Куриные эмбрионы выращивают в инкубаторе 7—10 дней, а затем используют для культивирования. В этой модели все типы зачатков тканей подвержены заражению. Но не все вирусы могут размножаться и развиваться в куриных эмбрионах. К достоинствам модели относятся возможность накопления вирусов в больших количествах, стерильность объекта, отсутствие скрытых вирусных инфекций, простота техники работы. Для культивирования вирусов исследуемый материал вводят в различные полости и ткани куриного зародыша. Используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования. Вирусы гриппа культивируются в 9-10, осповакцины - в 12, паротита - в 7-дневных куриных эмбрионах. Репродукция вируса в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша, что связано с особенностями тропизма вируса. Методику выращивания вируса в курином эмбрионе широко используют при промышленном культивировании.

В результате заражения могут происходить и появляться:

1) гибель эмбриона;

2) дефекты развития: на поверхности оболочек появляются образования – бляшки, представляющие собой скопления погибших клеток, содержащих вирионы;

3) накопление вирусов в аллантоисной жидкости (обнаруживают путем титрования);

4) размножение в культуре ткани (это основной метод культивирования вирусов).

Основные проявления цитопатического действия вирусов:

1) размножение вируса может сопровождаться гибелью клеток или морфологическими изменениями в них;

2) некоторые вирусы вызывают слияние клеток и образование многоядерного синцития;

3) клетки могут расти, но делиться, в результате чего образуются гигантские клетки;

4) в клетках появляются включения (ядерные, цитоплазматические, смешанные). Включения могут окрашиваться в розовый цвет (эозинофильные включения) или в голубой (базофильные включения);

5) если в культуре ткани размножаются вирусы, имеющие гемагглютинины, то в процессе размножения клетка приобретает способность адсорбировать эритроциты (гемадсорбция).