 |
Б. Микробиологический диагноз энтеровирусных инфекций
|
|
|
|
§ I. Вирусологический диагноз полиомиелита. Материалом для диагностики полиомиелита служат испражнения больного, готовят 10%-ную взвесь испражнений в растворе Хэнкса, центрифугируют и надосадочную жидкость обрабатывают антибиотиками (1000 ед, пенициллина и 1000 ед. стрептомицина на I мл). Подготовленный таким образом материал смешивают со свежей питательной средой. Выросшую однослойную культуру ткани просматривают под микроскопом и отбирают пригодную для заражения. Стерильной пастеровской пипеткой отсасывают питательную среду. В культуру ткани вносят I мл материала в свежей питательной среде и пробирку ставят в горизонтальном штативе в термостат.
§ 2. Серологический диагноз полиомиелита. Определение антител и их, титра к вирусу полиомиелита производят с помощью метода цветной пробы. Сыворотку больного полиомиелитом разводят в пробирках от 1:4 до 1:64 в объеме 0,25 мл. В каждую пробирку добавляют по 0,25 мл вируса полиомиелита и по 0,4 мл вазелинового масла. Через 40-60 минут в пробирки вносят по 0,25 мл клеточной суспензии, содержащей 100000 живых клеток в 1 мл. После инкубирования пробирок в термостате в течение 3-7 дней учитывают результат. Пожелтение среда в пробирках указывает на нейтрализацию вируса антителами и рост культуры клеток. Наибольшее разведение сыворотки, нейтрализующее вирус, является титром сыворотки.
Обнаружение противовирусных антител с помощью реакции преципитации
Реакция преципитации в агаре широко используется для диагностики вирусных заболеваний (полиомиелита, коксаки и др.) Реакция может быть поставлена в чашках Петри, на предметных стеклах и в капиллярах.
Постановка реакции преципитации на предметных стеклах. На обычные предметные стекла наносят 2 мл расплавленного и охлаждённого до 600 агара (1%-ный агар на физиологическом растворе с 1:20000 мертиолята). толщина слоя агара на стекле составляет около I мм. После застывания агара в нем вырезают лунки диаметром 3-4 мм с расстоянием между центрами луночек 5-6 мм. Количество луночек и их расположение на стекле могут быть различными в зависимости от условий опыта. Объем используемых ингредиентов 0,02 мл. Реакция ставится с несколькими контролями. Для определения антигена вируса вырезают 4 лунки (см. схему) и в каждую из них наливают соответственно следующие ингредиенты: специфическая сыворотка, специфический антиген, нормальная сыворотка, искомый антиген. Если искомый антиген соответствует сыворотке, то между соответствующими луночками должна появиться линия преципитации. Линия преципитации должна также появиться между лунками со специфической сывороткой и специфическим антигеном.
|
|
|
Преципитация наблюдается через 4-5 часов инкубации в термостате во влажной камере.
Рис.1 Схема постановки реакции преципитации в агаре для выявления вирусного антигена. Обозначения: Сс - сыворотка специфическая Сн - сыворотка нормальная Ас - антиген сцецифический Аи - антиген искомый
Рис.2 Схема постановки и результаты опыта по определению типа и титра противогриппозных антител в сыворотке больного.
Рис.3 Схема определения титра антител методом цветной пробы.
| Сыворотка в мл. | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | — | — |
| Вирус в мл. | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | — | — | 0,25 |
| Клетки в мл. | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 |
Заключение:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вирусологический (диагностика ОРЗ)
Рис.4 Смыв из носоглотки, обработанный антибиотиками
| Заражение куриных эмбрионов в аллантоисную или амниотическую полости. Вирус обнаруживают путем реакции гемаг-глютинации, типируют с помощью РТГА | Заражение культуры ткани. В культуре ткани вирус обнаруживают по цитопатическому эффекту, по изменению цвета среды и по реакции гамадсорбции; типируют по РТГА, нейтрализации ЦПЭ и реакции гемадсорбции. | Заражение белых мышей. Типируют вирус мотодом нейтрализации со специфическими сыворотками. |
|
|
|
I. Методы микробиологической диагностики острых респираторных заболеваний
А. Вирусоскопический
Материал со слизистой носа, зева эмульгируют в физиологическом растворе, осаждают и из осадка готовят мазки.
Мазки после высушивания обрабатывают типоспецифическими люминесцирущими сыворотками и микроскопируют с помощью люминесцентного микроскопа. Клетки, содержащие соответствующий вирус, адсорбируют специфические люминесцирующие антитела и светятся.
Б. Вирусологический (см. схему).
В. Серологический
Определяют нарастание титра специфических антител в исследуемых парных сыворотках с помощью РТГА, РСК и РН (см. схему).
П. Методы микробиологической диагностики энтеровирусных инфекций
А. Вирусологический
Поскольку вирусы Коксаки и ЕСНО могут вызывать полиомиелитоподобные заболевания, исследование ведется с целью возможного выделения любого из трех видов вируса, для чего вирус выделяется параллельно на культурах ткани и заражением однодневных мышей. (Схему см. ниже Рис.5). Материал: испражнения, иногда спинномозговая жидкость, слизь из зева, кровь.
Цитопатический эффект и образование бляшек (вирусы Коксаки часто не вызывают цитопатического эффекта).
Титрование выделенных вирусов с помощью реакции нейтрализации на культуре ткани с сыворотками против вирусов полиомиелита, вирусов Коксаки А и В, вирусов EСНО. При совпадении типов вируса и сыворотки отмечается рост культуры, изменение цвета среды и отсутствие бляшек.
Параличи и смерть наступают в присутствии вирусов Коксаки А и В.
Вирусы Коксаки А через 3-5 дней вызывают вялые параличи мышц с ценкеровским некрозом.
Вирусы Коксаки В через 6-8 дней вызывают некроз бурого жира в межлопаточной области и спастические параличи в результате поражения центральной нервной системы.
Б. Серологический
Обнаружение нарастания антител в крови больных к выделенным вирусам ECHO производят с помощью РТГА, к вирусам Коксаки - по реакции нейтрализации и цветной пробе, к вирусам полиомиелита - по реакциям нейтрализации, преципитации и РСК.
|
|
|
