 |
Метод окраски жгутиков по Ляйфсону
|
|
|
|
Метод окраски жгутиков по Ляйфсону
| Раствор 1: | |
| Хлористый натрий | 1, 5 г |
| Дистиллированная вода | 100 мл |
| Раствор 2: | |
| Дубильная кислота | 3, 0 г |
| Дистиллированная вода | 100 мл |
| Раствор 3: | |
| Уксуснокислый n-розанилин | 0, 9 г |
| Солянокислый n-розанилин | 0, 3 г |
| Этанол 95%-ный (объем/объем) | 100 мл |
Смешивают равные объемы растворов 1 и 2; затем два объема получившейся смеси приливают к одному объему раствора 3. В охлажденном виде полученная смесь хранится 1—2 мес.
Методика:
1. Высушенный на воздухе образец готовят в соответствии с 1-м и 2-м этапами метода Грэя.
2. Восковым стеклографом очерчивают вокруг мазка прямоугольник.
3. Наносят на предметное стекло 1 мл раствора красителя, так чтобы нисколько не вытекло за пределы восковой линии. Оставляют краситель приблизительно на 7—15 минут; оптимальное время реакции следует определить экспериментально.
4. Как только на поверхности красителя образуется золотистая пленка и при освещении снизу будет видно, что вся пленка сплошь покрыта осадком, краситель удаляют, заставляя «плыть» эту пленку по поверхности пущенной из-под крана струи воды. Пленку высушивают на воздухе и смотрят в микроскоп.
Тела и жгутики бактерий окрашиваются в красный цвет.
Окраска жгутиков серебрением
| Реактивы: | |
| 40% формалин | 1 мл |
| Дистиллированная вода | 100 мл |
| II | |
| Танин | 5 г |
| Дистиллированная вода | |
| Карболовая кислота (расплавленная) | 1 мл |
(Клемпарская предлагает применять, во избежание осадков, протраву в виде 2, 5—3% раствора танина. )
Раствор аммиачного серебра (III) готовят по следующей методике: 4 г азотнокислого серебра растворяют в 80 мл дистиллированной воды; затем к нему по каплям добавляют крепкий (25%) аммиак, пока образующийся темно-коричневый, а затем буро-черный осадок не растворится и останется лишь легкая опалесценция. Раствор очень стоек. Хранить в темной склянке с притертой пробкой (защищать от пыли! ). Перед окраской реактив разбавляется 1: 10 дистиллированной водой.
|
|
|
Приготовление бактериальной взвеси. Как правило, жгутики в старых культурах теряются. Иногда необходимы частые систематические пересевы в течение долгого времени на жидкие среды (ежедневные пересевы на свежие среды), пока подвижность микробов не восстановится. Хорошей средой для пересевов является обыкновенный или кровяной агар, свежий, с влажной поверхностью.
На границе с конденсационной водой осторожно захватывают петлей немного бактериальной массы, переносят ее в пробирку, где налито 0, 1—0, 2 мл 1% формалина (реактив I), легкими движениями петли распределяют микробные тела в жидкости. До окраски приготовленную эмульсию держат при 37° в течение 2 часов и более (сохраняется годами).
Приготовление стекол. Рекомендуют готовить препарат только на новых, еще не бывших в употреблении, безукоризненно чистых предметных стеклах. Стекла обрабатывают (для очистки) концентрированной соляной кислотой в течение 15 минут; затем кислоту сливают, остатки ее нейтрализуют крепким аммиаком, стекла промывают дистиллированной водой и переносят в чистый винный спирт. Вынутые из спирта (пинцетом! ) стекла тщательно протирают мягкой чистой тряпочкой. В чашечку или бюксу, где налито 3—4 мл дистиллированной воды, очень тонкой пипеткой вносят 1 каплю формалиновой бактериальной взвеси. Отсюда маленькой петлей наносят 5—6 отдельных капель взвеси на центральную часть предметного стекла, не касаясь петлей его поверхности и не размазывая капли. Когда капли высохнут на воздухе, приступают к их окраске.
Техника окраски.
|
|
|
1. На препарат (используя пинцет Корнэ! ) наливают протраву (реактив II) и в течение 1—2 минут подогревают до появления паров.
2. Тщательно смывают протраву дистиллированной водой (удалению протравы способствует протирание стекла вокруг мазка кусочком фильтровальной бумаги).
3. Обрабатывают препарат в течение 2—2, 5 минут раствором серебра (при легком подогревании, пока на препарате не станут видны весьма слабо окрашенные в коричневый цвет округлые пятна (рассматривать на белом фоне или в проходящем свете! ). Тщательно промывают мазок дистиллированной водой и высушивают на воздухе.
Микроскопическая картина: тела бактерий — угольно-черного цвета, жгутики — в виде тончайших волнообразно извитых нитей коричневого или янтарно-черного цвета на прозрачном или желтоватом гомогенном фоне.
Если жгутики не окрасились, удаляют масло с препарата ксилолом и вторично повторяют процедуру окраски, так как жгутики обнаруживаются только при особенно интенсивной окраске.
В препарате могут быть осадки или грязный фон вследствие переноса на стекло частиц агара, конденсационной воды или при употреблении плохо очищенных стекол, грязного пинцета, наконец, в том случае, если была плохо отмыта протрава.
Если бактериальная эмульсия слишком густа, то бактерии в мазке будут скучены и картина флагелляции вследствие беспорядочного сплетения жгутиков будет неясна. Желательно подобрать такую концентрацию, чтобы в одном поле зрения находилось от 5 до 10 отдельно расположенных бактерий с хорошо расправленными жгутиками.
Заготовляемые для хранения препараты заключают в парафиновое масло или чистый канадский бальзам под покровным стеклом, иначе они быстро обесцветятся под действием света. Несмотря на то, что окрашивание жгутиков считается одной из тонких микробиологических операций, окраска по Морозову при известной пунктуальности выполнения даже в руках начинающих дает прекрасные результаты.
|
|
|
