7. Структурные основы антигенной специфичности полисахаридов и нуклеиновых кислот.

7. Структурные основы антигенной специфичности полисахаридов и нуклеиновых кислот.

К АГ относятся белки, полисахариды, липополисахариды, нуклеиновые к-ты как в очищенном виде, так и в виде структурных компонентов различных биологических структур (клеток, тканей, вирусов и тд). Понятие аг детерминанта включает в себя последовательность образующих ее хим-х функциональных групп и их пространственное расположение. Белки – в молекулах белков АГ д-та образуется совокупностью аминокислотных остатков. АГ д-ты белков бывают двух типов- секвенциальные (т. е представляющие из себя последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи), и конформационные (образованные аминокислотными остатками из различных частей белковой цепи, но сближенные в пространственной конфигурации белковой глобулы). Во многих случаях единичная замена аминокислоты в структуре антигенной детерминанты или изменение конформации белковой глобулы яв-ся достаточными для изменения аг специфичности макромолекулы. Термин «специфичность аг» используется в двух смыслах: 1)как способность избирательно реагировать со специфическими антителами 2)поскольку белковые аг поливалентны, как набор определенных аг детерминант. Если два аг имеют только часть одинаковых аг детерминант, их называют перекрестно реагирующими аг. Знание аг специфичности яв-ся исключительно важным условием для создания диагностических иммунохимических наборов, т. к. позволяет проводить определение данного вещества в присутствии близкородственных соединений. Если обобщать данные о структуре аг детерминанты белков, можно выделить след. особенность – жесткий участок поверхности белковой глобулы, образованный одним или несколькими фрагментами полипептидной цепи, содержащими иммунодоминантную группу. Нуклеиновые кислоты – структура аг детерминант нк остается малопонятной, это обусловлено тем, что сами по себе нк практически не иммуногены, но в комплексе с белками к ним могут быть получены ат. Как и в случае белков, важную роль играет жестокость структуры полинуклеотида. В состав аг детерминанты входят три- и тетрануклеотиды. Они могут быть образованы как двуспиральными, так и односпиральными участками. Полисахариды – весьма сложная по составу и строение группа аг, входящая в структуру стенок микроорганизмов и многих други клеток и определяющая их специфичность. Они входят в состав многих белков и также играют роль аг детерминант. В большинстве случаев полисахаридные аг представляют собой длинную цепи, к которой присоединены боковые короткие олигосахариды, содержащие 4-6 остатков сахаров, фактически яв-ся аг детерминантами.

8. Гомогенные методы ИФА антигенов, основанные на использовании меченных ферментом антигенов.

К гомогенным относятся методы ИФА, осуществляемые в однофазной системе и не требующие стадии механического разделения образовавшихся комплексов. Эти методы, в основном, базируются на эффекте модуляции антителами активности фермента (или кофактора), используемого в качестве метки.

Все известные в настоящее время схемы проведения гомогенного ИФА относятся к типу II, т. е. во всех схемах регистрируется концентрация не образующегося специфического комплекса антитело — антиген, а оставшихся свободными центров специфического связывания. Однако, в противоположность гетерогенным схемам, наблюдаемая ферментативная активность, соответствующая концентрации незанятых мест специфического связывания, может как уменьшаться, так и увеличиваться, что обусловлено различной природой воздействия связывания лигандов на ферментативную активность.

Так же как и в случае гетерогенных методов, разнообразие гомогенных вариантов анализа обусловлено возможностью введения метки как в молекулу антигена, так и в молекулу антитела. Кроме того, по сравнению с гетерогенным ИФА гомогенный оперирует более широким кругом соединений, используемых в качестве метки. Кроме ферментов в нем применяют компоненты или эффекторы реакций, такие как, кофакторы, ингибиторы, простетические группы, субстраты.

Введение метки в молекулу антигена является одним из наиболее распространенных подходов в гомогенных методах ИФА. Эти методы относятся к конкурентным и основаны на одновременном взаимодействии с антителами анализируемого и меченого антигенов. После образования в растворе соответствующего иммунохимического комплекса проводят измерение ферментативной активности, которая пропорциональна концентрации свободного или связанного меченого лиганда.

Необходимым условием гомогенного ИФА является изменение наблюдаемой ферментативной активности при взаимодействии меченого антигена с антителами. Механизмы модуляции активности могут быть различными. К основным из них относятся следующие:

1)исключение субстрата из ферментативной реакции вследствие стерического затруднения взаимодействия субстрата с ферментом, возникающего при образовании иммунохимического комплекса меченого антигена с антителами;

2)индуцируемое антителами конформационное изменение структуры молекулы фермента-метки, приводящее к изменению ферментативной активности;

3)модуляция антителами способности кофакторов, субстратов, ингибиторов и других соединений участвовать в ферментативной реакции.

Методы анализа антигенов, основанные на использовании меченных ферментом антигенов. Стерическое исключение субстрата. На этом принципе был основан первый гомогенный метод ИФА, разработанный в 1972 г. н вошедший в литературу под названием

«ЕМ1Т» (enzyme multiplied immunoassay technique). Суть его состоит в следующем. Низкомолекулярный антиген ковалентно связывают с ферментом лизоцимом вблизи активного центра. В комплексе с антителами активный центр фермента становится стерически недоступен макромолекулярному субстрату, которым являются стенки бактериальных клеток.

При увеличении концентрации определяемого антигена концентрация неактивного комплекса конъюгата с антителами снижается, а следовательно, возрастает регистрируемый параметр ферментативной реакции. На основе данного подхода были разработаны наборы для определения широкого круга наркотических и лекарственных средств. Существенным достоинством EMIT-анализа является экспрессность определения, которая составляет 2—5 мин. К недостаткам метода следует отнести меньшую чувствительность, чем в гетерогенном ИФА (~ 1 мкг/мл), и возможность определения только низкомолекулярных антигенов.

Принцип стерического исключения субстрата был использован также для разработки метода определения макромолекулярных антигенов, таких, как альбумин, иммуноглобулины G и М. В анализе используют конъюгат антигена с бета-D-галактозидазой Е. coli. После образования комплекса с антителами активный Центр фермента становится недоступным для взаимодействия с искусственно синтезированным макромолекулярным субстратом о-нитрофенил-бета-D-гатактозидом, ковалентно связанным с водорастворимым полимерным декстраном. В присутствии антигена «степень ингибирования» фермента уменьшается пропорционально концентрации исследуемого соединения. Метод позволяет измерять IgG в микрограммовых количествах в течение нескольких минут.